Une méthodologie pour la préparation des nanopores à l'état solide en solution pour des expériences de translocation biomoléculaires est présenté. Par l'application d'impulsions courtes de champs électriques élevés, le diamètre de nanopore peut être agrandi de manière contrôlée avec une précision inférieure au nanomètre, et ses caractéristiques de bruit électrique nettement améliorée. Cette procédure est effectuée in situ en utilisant un équipement de laboratoire standard dans des conditions expérimentales.
Nanopores semi-conducteurs ont émergé comme un outil polyvalent pour la caractérisation des biomolécules uniques tels que des acides nucléiques et des protéines 1. Cependant, la création d'un nanopore dans une membrane isolante mince reste difficile. Les méthodes de fabrication impliquant des systèmes de faisceaux d'électrons focalisé spécialisés peuvent produire des nanopores bien définis, mais le rendement de nanopores fiables et à faible bruit dans les membranes disponibles dans le commerce reste faible 2,3 et le contrôle de la taille est non triviale 4,5. Ici, l'application de champs électriques haute pour affiner la taille de la nanopores tout en assurant une performance optimale à faible bruit est démontrée. Ces courtes impulsions de champ électrique élevé sont utilisés pour produire un signal électrique vierge et permettre l'élargissement de nanopores avec une précision inférieure au nanomètre lors d'une exposition prolongée. Ce procédé est réalisé in situ dans un milieu aqueux en utilisant un équipement de laboratoire standard, ce qui améliore le rendement et la reproductibilité des sétat-olid nanopores fabrication.
Nanopores à état solide biologique et fournissent un moyen de détection des analytes biomoléculaires à l'échelle de la molécule unique 1. Nanopores individuels sont généralement intégrés dans minces membranes d'isolation, fournissant le seul conduit pour le courant ionique pour passer entre deux réservoirs de liquide. En utilisant les principes de la plus grande échelle des compteurs Coulter, nanopore expériences concernent les variations du courant ionique pour déterminer la longueur, la taille, la charge et conformation de biomolécules chargées car ils sont entraînés par électrophorèse à travers un nanopore en présence d'un champ électrique externe.
Bien que nanopores biologiques tels que α-hémolysine offrent généralement une plus grande sensibilité et des propriétés à faible bruit 3, la bicouche lipidique de support est fragile et de taille fixe, ce qui limite leur applicabilité. Nanopores à l'état solide, d'autre part, sont fabriqués en mince (10 à 50 nm) de nitrure de silicium ou de membranes d'oxyde de silicium et peuvent être faits de différents sizes, être facilement intégré avec les technologies plaquette échelle 6,7, et sont plus robustes, ce qui permet une plus large gamme de conditions expérimentales. Malgré ces avantages, les technologies de nanopores semi-conducteurs souffrent de plusieurs inconvénients pratiques qui limitent leur utilité pour les études biomoléculaires. Bien que le contrôle de la taille des nanopores est possible, il est généralement coûteux et laborieux à réaliser, nécessitant un équipement spécialisé et de personnel qualifié. Par exemple, les nanopores percés par faisceau focalisé d'ions a été démontré récemment à se rétrécir dans des conditions expérimentales spécifiques dans un microscope électronique à balayage (SEM) 5. En d'autres approches, des nanopores forés par microscopie électronique à transmission (MET) peuvent se dilater ou se contracter en fonction des conditions de faisceau et une exposition ultérieure à des solvants aqueux 8. Dans ces cas, la gamme de tailles réalisable nanopore est limité, difficile à contrôler et peu fiable, même lorsque la taille du nanopore peut changer après un traitement chimique oulorsqu'il est immergé dans un milieu liquide particulier 9.
Le courant ionique à travers des nanopores à l'état solide peut également souffrir de bruit élevé, dont les sources sont un sujet intensément étudié dans la littérature nanopores 2,3,10,11. Bien que diverses méthodes ont été proposées pour réduire le bruit électrique, le rendement de fiables, stables nanopores à faible bruit est généralement faible. Le dépôt de résidus carbonés en cours de forage et d'imagerie peut avoir des effets néfastes sur la qualité du signal électrique, ce qui rend souvent difficile mouillage complet et provoquant la formation d'nanobubbles qui peuvent être difficiles à enlever 12. Par ailleurs, le colmatage du nanopore par molécules d'analyte dégrade le rendu de la qualité de signal des pores inutilisable pour autre expérience 13,14. Au total, ces effets réduisent considérablement le rendement des dispositifs de nanopores fonctionnels et augmentent le coût associé à la recherche de nanopores à l'état solide.
L'applicationtion d'une tension avec des électrodes Ag / AgCl pour produire des champs électriques élevés de l'ordre de 0,15-0,3 V / nm présente une solution étonnamment simple à ces défis. Grâce à l'application cyclique d'impulsions de courte de tension, un endroit propre, à faible bruit surface de nanopores idéal pour les études d'une seule molécule est produite. Une exposition prolongée à des champs électriques élevés initie l'enlèvement de la matière de membrane constituant la paroi des pores, ce qui entraîne une augmentation du diamètre des nanopores. Cette croissance peut être contrôlée avec précision par réglage de la force d'impulsion et de durée. Comme des traces de courant se dégradent au cours d'une expérience en raison de l'obstruction de la nanopore que les molécules sont adsorbées à la surface de nanopores, ce processus peut être répété pour récupérer les appareils obstrués qui auraient autrement été mis au rebut. En tant que tel, le rendement de nanopores fonctionnels est encore accrue par la possibilité d'utiliser le même dispositif à plusieurs reprises. Cette méthode présente plusieurs avantages car il est effectué rapidement dans un liquide sous expérimentalconditions, ne nécessite que du matériel de laboratoire standard, peuvent être automatisées avec le logiciel, et produit fonctionnels nanopores de haute qualité avec un rendement de plus de 95%.
Le contrôle de la taille des nanopores est d'une importance fondamentale dans les applications de détection biomoléculaires. diamètres de Nanopore doivent être de l'ordre de la taille des molécules étant sondés, ils doivent être suffisamment grand pour accueillir l'échantillon, mais assez petit pour atteindre signal sur bruit optimal. Alors que le contrôle de la taille en utilisant la méthode présentée d'appliquer des champs électriques élevés est unidirectionnel en ce que le diamètre de nanopores ne sont augmentés au long du processus, nanopores de diamètres compris entre 3-100 nm peuvent être façonné, avec une précision inférieure au nanomètre. Comme 3-4 pores nm peuvent être facilement fabriqués en utilisant un TEM 23, ce qui permet pour la fabrication fiable de nanopores à état solide pour une vaste gamme d'applications de sonder la structure ADN simple brin à l'interaction de complexes protéine-ligand volumineux. Alors que la croissance de nanopores plus de 100 nm peut être très rapide et moins précis, les conditions d'agrandissement plus modérés peuvent être utilisés pour obtenir un meilleur contrôle sur le processus. Comme such, l'étape la plus importante pour réaliser un contrôle efficace de taille est le choix de la résistance et de la durée d'impulsion, afin d'équilibrer l'efficacité agrandissement et le niveau de précision requis pour parvenir à un diamètre de pore désiré. Cela est en outre mis en évidence par l'élargissement de nanopores minces (épaisseur 10 nm), où l'élargissement est observé un biais plus faible, mais l'intensité du champ électrique comparable. En fonction de la taille finale, il est généralement possible d'agrandir le diamètre d'un nanopore sub-100-nm en quelques minutes.
De même, les grandes fluctuations de courant de basse fréquence empêchent études molécule unique car il est presque impossible de différencier les signaux de translocation du bruit de fond. Mouillage incomplet 24, la présence de résidus carbonés restant après la fabrication initiale 25 et l'adsorption de débris sur le mur de nanopores 13 peut dégrader la qualité du signal, nécessitant un nettoyage supplémentaire avec des traitements chimiques agressifs qui sont souvent inefficacious. Fait intéressant, il est courant pour les protocoles de nanopores à état solide pour souligner l'importance du nettoyage de la nanopores dans une solution de piranha ou avec un plasma d'oxygène avant de monter à l'aide de mouillage ou de supprimer toute contamination laissés par les processus de forage, d'imagerie et de manutention. Même avec ce traitement, cependant, nanopores font souvent pas humide ou continuent de faire preuve de bruit élevé, et la solution proposée pour tentatives infructueuses est d'effectuer un nettoyage supplémentaire qui peut être extrêmement chronophage 14. Avec l'application de champs électriques élevés, ces longs protocoles peuvent ne pas être nécessaires en fonction de l'application. Il a été constaté que la plupart des appareils peuvent être reconditionnés in situ en utilisant la méthode décrite ici, par conséquent de réduire le temps de préparation et la nécessité de traiter avec des produits chimiques. Les étapes les plus importantes dans l'atténuation du bruit électrique est une simple augmentation de la tension et / ou de la durée d'impulsion pour mouiller complètement les pores et enlever les débris faiblement lié.Nanopores traités de cette manière peuvent être utilisés de manière fiable dans des expériences de translocation de biomolécules, telles que le passage de l'ADN et des protéines. Si ces molécules adhèrent à la paroi des pores conduisant à un signal électrique bouché et bruyant, les impulsions de champ électrique peuvent être appliqués à nouveau pour éliminer l'obstruction et de retrouver les propriétés à faible bruit pour de nouvelles expérimentations, sans démontage de la puce de nanopores de la cellule fluidique.
L'application de champs électriques élevés à l'aide de la configuration décrite est limitée par l'exigence d'une alimentation externe qui peut s'appliquer jusqu'à 10 V et amplificateur de courant, qui n'ont pas la sensibilité et les propriétés à faible bruit à bande passante élevée (> 1 kHz) pour seule détection de molécule. Bien que les expériences biomoléculaires typiques reposent sur un amplificateur de courant faible bruit qui est limitée à ± 1 V, il est facile de concevoir un système unique qui pourrait accomplir à la fois domaine de la haute conditionné électrique et la mesure du courant sensible avec un adjule gain stable. Malgré cette limitation, le passage d'une configuration à l'autre est rapide et simple. En comparaison avec les techniques existantes pour contrôler la taille de l'nanopore telles que l'utilisation de la SEM 5, l'oxydation thermique et la membrane remodelage 8, des champs électriques élevés offrent une méthode plus rapide, plus précise et moins coûteuse qui peut être effectuée sur le banc de laboratoire en utilisant un équipement standard et fournir un plus large éventail de tailles de nanopores. La capacité à réduire rapidement et de manière reproductible bruit basse fréquence permet également la fabrication initiale plus fiable et prolonge la durée de vie des nanopores à l'état solide, que les pores utilisés précédemment peuvent être rajeunis pour d'autres expériences. Au total, plus de 95% des nanopores de différentes épaisseurs climatisées avec des champs électriques élevés présentait très peu caractéristique de bruit basse fréquence, ce qui les rend appropriés pour biomolécule détection. La fabrication est donc plus facile et plus fiable, de faire des expériences de nanopores semi-conducteurs plus l'accessibilitéble pour les chercheurs et permettant potentiellement d'un chemin vers la commercialisation de technologies de nanopores à travers des processus de fabrication plus robustes.
The authors have nothing to disclose.
Nous reconnaissons l'appui du Conseil de recherches en génie du Canada, la Fondation canadienne pour l'innovation, et le Fonds de recherche en sciences naturelles et en Ontario. Nous remercions Y. Liu de l'aide dans nanopores fabrication et la caractérisation, L. Andrzejewski pour des discussions utiles et de soutien technique, et A. Marziali l'aide d'un logiciel de nanopores et la conception de l'instrumentation.
JEM-2100F TEM | JEOL | Drilling requires 200 kV accelerating voltage | |
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | Low-noise voltage and current amplifier | |
X-Series data acquisition card | National Instruments | PCI-6351 | Interfacing with setup, apply of high electric fields |
LabVIEW 2012 software | National Instruments | Apply voltages, record current, data analysis | |
Current amplifier | Keithley | Current amplification during high electric field pulses | |
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005X | Substrate in which nanopores are created |
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005Z | Substrate in which nanopores are created |
Silicone elastomer O-rings | Marian Chicago | HT6135 | Punched for sealing the nanopore chip |
Ag/AgCl electrodes | In Vivo Metric | E255 | |
Nitric acid | Fisher Scientific | 52004P | Used for cleaning cells – handle with caution |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H323 | Used for piranha solution – handle with caution |
Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | Used for piranha solution – handle with caution |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P335 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310 | Buffering KCl solution |
Primary Faraday cage | Shielding nanopore cell, electrodes | ||
Secondary Faraday cage | Shielding headstage, electrode wires | ||
Teflon cell | To hold nanopore chip and reservoirs | ||
Hot plate | VWR | Heating piranha solution |