生体分子転位実験のために、溶液中の固体ナノ細孔を製造するための方法が提示される。高電界の短いパルスを印加することにより、ナノ細孔径がサブナノメートルの精度で制御可能に大きくすることができ、その電気的なノイズ特性が大幅に改善。この手順は、実験条件下で標準的な実験装置を用いてその場で実行される。
固体ナノ細孔は、核酸やタンパク質などの1つの生体分子の特性評価のための汎用的なツールとして浮上している。しかしながら、薄い絶縁膜中のナノポアの作成は困難なままである。特殊な集束電子ビームシステムを含む製造方法は、明確に定義されたナノ細孔を生成することができるが、市販の膜で信頼性が高く、低騒音ナノポアの収率は、2,3低いままとサイズ制御が4,5自明である。ここで、微調整に高電界の印加は、最適な低ノイズ性能を確保しつつ、ナノポアの大きさが実証される。高電界のこれらの短いパルスは、自然のままの電気信号を発生し、長時間露光時にサブナノメートルの精度でナノ細孔の拡大を可能にするために使用される。この方法は、複数の収率及び再現性を向上させる、標準的な実験装置を用いて水性環境中でその場で行われるオリッ状態ナノ細孔の製造。
生物学的および固体ナノ細孔は、単一分子レベル1での生体分子の分析物を検出する手段を提供する。個々のナノ細孔は、通常、2つの液体リザーバ間を通過するイオン電流のための唯一の導管を提供する、薄い絶縁膜に埋め込まれている。大規模コールターカウンターの原理を利用して、ナノポア実験は、それらが電気泳動的に外部電場の存在下でナノ細孔を介して駆動されるように、荷電した生体分子の長、大きさ、電荷および立体配座を決定するために、イオン電流の変化を関連付ける。
例えば、α-溶血素のような生物学的ナノポアは、典型的には、高い感度と低ノイズ特性3を提供していますが、支持脂質二重層は、それらの適用性を制限し、壊れやすく、固定サイズのものである。固体ナノ細孔は、一方では、薄い(10〜50 nm)のシリコン窒化物又はシリコン酸化膜で作製され、異なるSIZで作ることができるエス、容易にウェーハスケール技術6,7と一体化し、より堅牢であり、実験条件のより広い範囲を可能にする。これらの利点にもかかわらず、固体ナノポア技術は、生体分子研究のためのそれらの有用性を制限するいくつかの実用的な欠点がある。ナノ細孔径の制御が可能であるが、特殊な装置や熟練した人員を必要とし、達成するために、典型的には高価で面倒である。例えば、集束イオンビームにより穿孔ナノポアは最近、走査型電子顕微鏡(SEM)5内の特定の実験条件下で収縮することが示されている。他のアプローチでは、透過型電子顕微鏡(TEM)により穿孔ナノ細孔は、ビーム条件および水性溶媒8に続く暴露に応じて拡張または縮小することができる。これらの場合において、ナノ細孔サイズの達成可能な範囲は、化学治療の後、限られた制御が困難でかつナノポアの大きさが変更できるので、さらに信頼性がない又は特定の液体環境9中に浸漬したとき。
固体ナノ細孔を通るイオン電流も高く、ノイズに悩まされることができる、のソースは、ナノ細孔文献2,3,10,11において激しく調査し話題です。種々の方法は、電気ノイズを低減するために提案されているが、信頼性の高い、安定した低ノイズナノポアの収率は、典型的には低い。掘削および撮像中の炭素質残留物の堆積は、多くの場合、完全な濡れにチャレンジを行うと12を除去することは困難であるナノバブルの形成を引き起こし、電気信号の品質に有害な影響を有することができる。また、検体分子によるナノポアの目詰まりがさらなる実験のために使用できない孔13,14をレンダリングする信号品質を劣化させる。要するに、これらの効果が大きく官能ナノポア装置の歩留まりを低下させ、固体ナノポアの研究に関連するコストを増加させる。
アプリケーション0.15 V / 100nmの範囲で高電界を生成するためのAg / AgCl電極の電圧のTiONからは、これらの課題に対する驚くほど簡単な解決策を提示する。短い電圧パルス、単分子研究のためのクリーンな低ノイズナノ細孔表面の理想的な周期的なアプリケーションを介して生成される。高電界への長期暴露は、ナノ細孔径の増大をもたらす細孔壁を構成する膜材料の除去を開始する。この成長は、正確に、パルス強度及び持続時間を調整することによって制御することができる。分子がナノ細孔表面に吸着するような電流トレースによるナノ細孔の目詰まりによる実験の経過と共に劣化したように、このプロセスは、そうでなければ廃棄される詰まっデバイスを回収するために繰り返すことができる。このように、機能的なナノ細孔の収率はさらに、同じデバイスを複数回使用する能力によって増大する。それは迅速に実験で液体で実行されるように、この方法にはいくつかの利点を提供する条件は、唯一の標準実験室装置を必要とするソフトウェアで自動化することができ、95%以上の収率で官能高品質のナノ細孔を生成する。
ナノ細孔径の制御は、生体分子センシング用途において基本的に重要である。ナノポアの直径はプローブされる分子の大きさのオーダーである必要があり、彼らは、試料を収容するのに十分大きいが、最適な信号対雑音を達成するのに十分に小さくなければならない。高電界を印加すると提示された方法を使用してサイズの制御が唯一のプロセスを通じて増加することをナノ細孔径の単方向ですが、3-100ナノメートルの直径を有するナノ細孔は、サブナノメートルの精度で、作ることができます。 3-4 nmの細孔が容易にTEM 23を用いて製造することができるように、これは、嵩高いタンパク質-リガンド複合体の相互作用のssDNA構造をプロービングより広い範囲のアプリケーションの固体ナノポアの信頼できる製造を可能にする。 100nmの前記ナノ細孔の成長が非常に速く、それほど正確であることができるが、より穏やかな条件は、拡大プロセスのよりよい制御を実現するために用いることができる。 sとUCH、効果的なサイズ制御を達成するための最も重要なステップは、拡大効率及び所望の孔径を達成するために要求される精度のレベルのバランスをとるために、パルスの強度および持続時間の選択である。これをさらに拡大が低いバイアスしかし同等の電界強度が観測される薄いナノ細孔(10nmの厚さ)の拡大によって強調される。最終的なサイズによっては、数分で、サブ100 nmの直径にナノ細孔を拡大することが一般的に可能である。
それは、バックグラウンドノイズからトランスロケーション信号を区別することはほぼ不可能であると同様に、大型の低周波電流の変動は、単分子研究を排除する。不完全な24湿潤 、最初の製造25とナノ細孔壁13上の破片の吸着後に残っている炭素質残留物の存在は、多くの場合、私がある過酷な化学治療と追加の清掃を必要とする、信号品質を劣化させることができますnefficacious。興味深いことに、それは、湿潤を補助又は穿孔、イメージングおよび取り扱いプロセスから残さ汚染を除去するために実装する前に、ピラニア溶液中または酸素プラズマでナノポアを洗浄することの重要性を強調するために、固体ナノポアプロトコルのが一般的である。でも、この治療で、しかし、ナノ細孔は、多くの場合、濡れないか、高ノイズを発揮し続け、失敗した試行のための提案された解決策は、非常に時間がかかり、14可能な追加の洗浄を行うことである。高電界を印加すると、これらの長いプロトコルは、用途に応じて必要ではないかもしれない。これは、ほとんどのデバイスが、結果として準備時間および過酷な化学物質に対処する必要性を低減する、本明細書に記載した方法を用いてその場で再調整することができることが分かった。電気的ノイズを緩和する上で最も重要なステップは完全にポアを濡らし、ゆるく結合したデブリを除去するための単純な電圧の上昇及び/又はパルス持続時間である。このように処理されたナノ細孔を確実にそのようなDNAおよびタンパク質の通路としての生体分子転位実験で使用することができる。これらの分子は目詰まりやノイズの多い電気信号に通じる細孔壁に付着した場合、高電界パルスが障害物を除去し、流体セルからナノポアチップのマウントを解除することなく、更なる実験のための低ノイズ特性を回復するために再適用することができる。
記載のセットアップを使用して高電界の印加は、高帯域幅(> 1kHzの)における感度と低ノイズ特性を欠くV 10及び電流増幅器まで適用することができ、外部電源の必要条件によって制限されるため単一分子センシング。典型的な生体分子の実験は±1 Vに制限され、低雑音増幅器電流に依存するが、adjuで高電界調節および感受性電流の測定の両方を達成することができる単一のシステムを設計することは簡単である安定した利得。この制限にもかかわらず、他の1セットアップからの移行は、迅速かつ簡単です。例えば、SEM 5、熱酸化および8整形膜の使用として、ナノポアの大きさを制御するための既存の技術に比べて、高い電界が標準的な装置を用いて実験台上で実施し、提供することができるより速く、より正確かつより安価な方法を提供ナノ細孔サイズの広い範囲。迅速かつ再現低周波ノイズを低減する能力は、最初の製造の信頼性になり、以前に使用した細孔がさらなる実験に若返ることができるように、固体ナノポアの寿命を延長する。要するに、高電界でコンディショニング様々な厚さのナノ細孔の95%以上は、生体分子検出に適した、それらをレンダリングする、非常に小さな低周波ノイズ特性を示した。製造は、よりaccessi固体ナノ細孔実験を行う、このように簡単に、より信頼性がある研究者へのBLE、潜在的に、より堅牢な製造プロセスによってナノ細孔技術の実用化への道を可能にする。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、自然科学とカナダの工学研究評議会、イノベーションのためのカナダの財団、オンタリオ研究基金による支援を認める。私たちは、ナノ細孔ソフトウェアと計装設計のヘルプのための貴重な議論と技術的なサポートのためのナノ細孔の製造および特性評価、L. Andrzejewskiの補助のためにYの劉に感謝し、A. Marziali。
JEM-2100F TEM | JEOL | Drilling requires 200 kV accelerating voltage | |
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | Low-noise voltage and current amplifier | |
X-Series data acquisition card | National Instruments | PCI-6351 | Interfacing with setup, apply of high electric fields |
LabVIEW 2012 software | National Instruments | Apply voltages, record current, data analysis | |
Current amplifier | Keithley | Current amplification during high electric field pulses | |
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005X | Substrate in which nanopores are created |
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005Z | Substrate in which nanopores are created |
Silicone elastomer O-rings | Marian Chicago | HT6135 | Punched for sealing the nanopore chip |
Ag/AgCl electrodes | In Vivo Metric | E255 | |
Nitric acid | Fisher Scientific | 52004P | Used for cleaning cells – handle with caution |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H323 | Used for piranha solution – handle with caution |
Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | Used for piranha solution – handle with caution |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P335 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310 | Buffering KCl solution |
Primary Faraday cage | Shielding nanopore cell, electrodes | ||
Secondary Faraday cage | Shielding headstage, electrode wires | ||
Teflon cell | To hold nanopore chip and reservoirs | ||
Hot plate | VWR | Heating piranha solution |