Biyomoleküler translokasyon deneyler için çözelti içinde katı-hal nanopores hazırlanması için bir yöntem sunulmuştur. Yüksek elektrik alanların kısa darbeleri uygulayarak, nanopore çapı kontrollü subnanometer hassasiyetle genişlemiş olabilir ve elektriksel gürültü karakteristikleri önemli ölçüde geliştirilmiş. Bu prosedür, deney koşulları altında, standart laboratuar ekipmanı kullanılarak yerinde gerçekleştirilir.
Solid-state nanopores gibi nükleik asitlerin ve proteinlerin 1 gibi tek biyomoleküllerin karakterizasyonu için çok yönlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bununla birlikte, ince bir yalıtım zar içinde bir nano-gözeneklere yaratılması zor olmaya devam etmektedir. Özel odaklanmış elektron ışını sistemlerini içeren fabrikasyon yöntemleri iyi tanımlanmış nanopores üretebilir, ancak piyasada mevcut zarlarında, güvenilir ve düşük gürültü nanopores verimi 2,3 düşük kalır ve boyut kontrol 4,5 saçma değildir. Burada, ince ayar yüksek elektrik alanların uygulama optimal düşük gürültü performansı sağlarken Nanopore boyutu gösterilmiştir. Yüksek elektrik alanının, kısa darbeler bozulmamış bir elektrik sinyali üreten ve uzun süreli maruz kalma üzerine subnanometer hassasiyetle nanopores büyütülmesi için izin vermek için kullanılır. Bu yöntem, s veriminin ve yeniden üretilebilirliğinin geliştirilmesi, standart laboratuar ekipmanı kullanarak sulu bir ortam içinde yerinde gerçekleştirilirolid-state nanopore fabrikasyon.
Biyolojik ve katı-hal nanopores tek molekül düzeyinde 1 biyomoleküler analitlerinin algılama için bir araç sağlar. Bağımsız nanopores genellikle iki sıvı rezervuar arasında geçmesine iyonik akımı için tek boru sağlayan, ince yalıtım membran gömülür. Daha büyük ölçekli bir Coulter sayacı prensiplerini kullanarak, çok küçük gözenek deneyler bu elektroforetik olarak bir dış elektrik alanı varlığında, bir nano-gözenekler ile tahrik edildiği gibidir yüklü biyomoleküllerin uzunluğu, boyut, yük ve yapısını belirlemek için iyonik akımında bir değişiklik ile ilgilidir.
Böyle α-hemolisin gibi biyolojik nanopores genellikle daha büyük bir duyarlılık ve düşük gürültü özelliklerini 3 sunarken, destekleyen çift katlı lipid uygulanabilirliğini sınırlayan, kırılgan ve sabit bir boyutu. Solid-state nanopores, diğer taraftan, ince (10-50 nm) silisyum nitrür ya da silisyum oksit zarlarında imal edilir ve farklı sIz yapılabilires, kolayca gofret ölçekli teknolojileri 6,7 ile entegre ve daha sağlam, deneysel koşullarda daha geniş bir aralığı için izin olabilir. Bu avantajlara rağmen, solid-state nanopore teknolojileri biyomoleküler çalışmaları için kullanışlılığını sınırlayan birkaç pratik sakıncaları muzdarip. Küçük gözenek boyutunun kontrolü mümkün olsa da, bu özel bir donanım ve kalifiye personel gerektiren, elde etmek için genellikle, pahalı ve zahmetli bir iştir. Örneğin, odaklanmış iyon demeti tarafından açılan nanopores yakın bir tarama elektron mikroskobu (SEM) 5'te belirli deney koşulları altında küçültmek için gösterilmiştir. Diğer yaklaşımlarda, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) tarafından açılan nanopores ışın koşulları ve sulu çözücülerin 8 sonraki maruz bağlı olarak genişletmek veya küçültmek olabilir. Nanopore büyüklüğü kimyasal muamele ya da aşağıdaki değişiklik gibi, bu durumda da, çok küçük gözenek boyutları elde aralığı sınırlı kontrolü zor ve hatta güvenilmezBelirli bir sıvı ortamda 9 içine daldırıldığında.
Solid-state nanopores aracılığıyla iyonik akım da yüksek gürültü muzdarip olabilir, kaynaklarıdır nanopore literatürde 2,3,10,11 bir yoğun araştırıldı konudur. Çeşitli yöntemler, elektriksel gürültüyü azaltmak için önerilmiş olsa da, güvenilir ve kararlı düşük gürültü nanopores verimi tipik olarak düşüktür. Sondaj ve görüntüleme sırasında karbonlu artıkların birikmesi sıklıkla tam ıslatma bir meydan okuma yapma ve 12 kaldırmak için zor olabilir nanobubbles oluşumuna neden, elektrik sinyali kalitesi üzerinde zararlı etkileri olabilir. Ayrıca, analit molekülleri tarafından Nanopore tıkanma sinyal kalitesi render başka deneyde 13,14 için kullanılamaz hale gözenekleri düşürür. Toplamda, bu etkileri büyük ölçüde işlevsel Nanopore cihazların verimini azaltır ve katı-hal Nanopore araştırma ile ilişkili maliyetini artırabilir.
Uygulamalar0,15-0,3 V / nm aralığında yüksek elektrik alanları üretmek için Ag / AgCl elektrotlu bir voltaj tion, bu sorunlar için şaşırtıcı derecede basit bir çözüm sunar. Kısa voltaj darbeleri, tek-molekül çalışmalar için temiz, düşük gürültü Nanopore yüzey ideal döngüsel uygulama sayesinde üretilir. Yüksek elektrik alanlarına uzun süre maruz kalmak küçük gözenek çapında bir artışa neden gözenek duvarı oluşturan zar malzemesi, kaldırılmasını başlatır. Bu büyüme, tam olarak darbe gücü ve süresi ayarlanması sureti ile kontrol edilebilir. Moleküller nanopore yüzeye adsorbe olarak mevcut izleri nedeniyle Nanopore tıkanma bir deney boyunca aşağılamak gibi, bu süreç aksi takdirde iptal olurdu tıkalı cihazları kurtarmak için tekrar edilebilir. Bu nedenle, fonksiyonel nanopores verimi daha da birden çok kez, aynı cihazı kullanma yeteneği artar. Bu hızlı bir şekilde deneysel altında sıvı içinde gerçekleştirilir ki bu yöntem çeşitli avantajlar sağlarkoşullar, ancak standart laboratuar ekipmanı gerektirir yazılımı ile otomatik olabilir ve% 95 üzerinde bir verimle fonksiyonel, yüksek kaliteli nanopores üretir.
Nanopore boyut kontrolü biyomoleküler algılama uygulamalarında temel bir öneme sahiptir. Nano-gözeneklere çapları problanmış olan moleküllerin büyüklüğü sırasına olmalıdır, bunlar örnek karşılamak için yeterince büyük, ancak en uygun bir sinyal-gürültü elde etmek için yeterince küçük olmalıdır. Boyutunun kontrol yüksek elektrik alanı uygulanması sunulan yöntemi kullanırken bu küçük gözenek çapları, yalnızca tek yönlü işlem boyunca artar, 3-100 nm arasında çaplara sahip nanopores subnanometer hassasiyetle moda olabilir. 3-4 nm gözenekleri hemen bir TEM 23 kullanılarak imal edilebilir, bu hacimli ligand-protein komplekslerinin etkileşimine ssDNA yapı tarama gelen geniş bir uygulama yelpazesi için katı-hal nanopores güvenilir bir imalat sağlar. 100 nm üzerinde küçük gözenek büyüme çok hızlı ve daha az hassas olabilir, daha ılımlı koşullar büyütme işlemi üzerinde daha iyi kontrol sağlamak için kullanılabilecektir. S olarakuch, etkili boyutu kontrolü sağlamak için en önemli adım büyütme verimliliği ve istenilen gözenek çapı ulaşmada gerekli hassasiyet seviyesini dengelemek için darbe gücü ve süresi seçimdir. Bu daha fazla genişleme düşük bir önyargı ancak karşılaştırılabilir elektrik alan kuvveti görülmektedir tiner nanopores (10-nm kalınlık), genişleme ile vurgulanır. Son boyutuna bağlı olarak, bir kaç dakika içinde alt-100-nm çaplarına Nanopore büyütmek için genel olarak mümkündür.
Bu arka plan gürültü translokasyon sinyallerini ayırt etmek neredeyse imkansız olduğu gibi benzer şekilde, büyük düşük frekans akım dalgalanmaları tek-molekül çalışmalarını engellemektedir. Eksik 24 ıslatma, ilk üretim 25 ve nanopore duvara 13 enkaz emilmesinden sonra kalan karbonlu kalıntıların varlığı genellikle i olan sert kimyasal tedaviler ile ek temizlik gerektiren, sinyal kalitesini düşürebilirnefficacious. Solid-state nanopore protokoller ıslanmasına yardımcı veya delme, görüntüleme ve işleme süreçlerinden arta kalan herhangi bir kontaminasyonu temizlemek için montaj önce piranha çözüm veya oksijen plazma ile Nanopore temizlik önemini vurgulamak için İlginçtir, bu yaygındır. Hatta bu tedavi ile, ancak, nanopores sık sık ıslak değil yapmak ya da yüksek gürültü sergilemeye devam ve başarısız girişimleri için önerilen çözüm son derece zaman alıcı olabilir 14 ek temizlik yapmaktır. Yüksek elektrik alanların uygulama ile, bu uzun protokoller, uygulamaya bağlı olarak gerekli olmayabilir. Bu aygıtların çoğu zaman sonuç olarak hazırlanması ve sert kimyasallar ile başa çıkmak için gereksinimini azaltır, burada tarif edilen yöntem kullanılarak in situ yenilenmiş edilebilir olduğu bulunmuştur. Elektriksel gürültü azaltıcı en önemli adımlar tamamen gözenek ıslak ve gevşek bağlı enkaz kaldırmak için voltaj ve / veya darbe süresi basit bir artış var.Bu şekilde muamele edilmiş Nanopores güvenilir bir DNA ve proteinlerin geçişi olarak biyomolekül translokasyon deneylerde de kullanılabilir. Bu moleküller bir tıkanmış ve gürültülü elektrik sinyaline yol açan gözenek duvarına yapışır ise, yüksek elektrik alan bakliyat engeli çıkarın ve akışkan hücreden nanopore çip ayrılması olmadan, daha sonraki denemeler için düşük gürültü özelliklerini kazanmak için yeniden uygulanabilir.
Açıklanan kurulumu kullanarak yüksek elektrik alanların uygulama için yüksek bant genişliği (> 1 kHz) de hassasiyeti ve düşük gürültü özelliklerini eksikliği 10 V ve akım amplifikatörü, kadar uygulayabileceğiniz bir harici güç kaynağı ihtiyacı ile sınırlıdır tek molekül algılama. Tipik Biyomoleküler deneyler ± 1 V ile sınırlıdır düşük gürültü akım amplifikatörü güveniyor iken, bir Adju yüksek elektrik alan klima ve hassas akım ölçümü hem de başarabileceği tek bir sistem tasarımı basittiristikrarlı kazanç. Bu sınırlamaya rağmen, diğer bir kurulumdan geçiş hızlı ve basittir. Örneğin SEM 5, termal oksidasyon ve 8, şekillendirme zarın kullanımı gibi küçük gözenek boyutunu kontrol etmek için var olan teknikler ile karşılaştırıldığında, yüksek bir elektrik alanı standart ekipmanlar kullanılarak laboratuar tezgah üzerinde yapılır ve temin edilebilir, daha hızlı, daha hassas ve daha ucuz bir yöntem tavsiye Nanopore boyutları daha geniş bir dizi. Hızlı ve tekrarlanabilir düşük frekanslı gürültüyü azaltmak için yeteneği de ilk üretim daha güvenilir hale getirir ve daha önce kullanılan gözenekler daha fazla deneyler için gençleşmek gibi, katı-hal nanopores ömrünü uzatır. Toplamda, yüksek elektrik alanları ile klimalı değişen kalınlıklarda nanopores% 95 üzerinde biomolekül algılama için uygun hale getirilerek, çok az düşük frekanslı gürültü karakteristiği sergiledi. Fabrikasyon solid-state nanopore deneyleri daha accessi yapma, böylece daha kolay ve daha güvenilirAraştırmacılara ble ve potansiyel olarak daha güçlü fabrikasyon süreçleri aracılığıyla Nanopore teknolojilerin ticarileştirilmesi yönünde bir yol için izin.
The authors have nothing to disclose.
Biz Doğa Bilimleri ve Kanada, Kanada Yenilik Vakfı, ve Ontario Araştırma Fonu Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından destek için minnettarım. Biz Nanopore yazılım ve enstrümantasyon tasarımı ile yardım için değerli tartışmalar ve teknik destek için Nanopore imalat ve karakterizasyonu, L. ANDRZEJEWSKI yılında yardım için Y. Liu teşekkür, ve A. marziali.
JEM-2100F TEM | JEOL | Drilling requires 200 kV accelerating voltage | |
Axon Axopatch 200B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | Low-noise voltage and current amplifier | |
X-Series data acquisition card | National Instruments | PCI-6351 | Interfacing with setup, apply of high electric fields |
LabVIEW 2012 software | National Instruments | Apply voltages, record current, data analysis | |
Current amplifier | Keithley | Current amplification during high electric field pulses | |
30-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005X | Substrate in which nanopores are created |
10-nm thick silicon nitride TEM membrane windows | Norcada Inc. | NT005Z | Substrate in which nanopores are created |
Silicone elastomer O-rings | Marian Chicago | HT6135 | Punched for sealing the nanopore chip |
Ag/AgCl electrodes | In Vivo Metric | E255 | |
Nitric acid | Fisher Scientific | 52004P | Used for cleaning cells – handle with caution |
Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H323 | Used for piranha solution – handle with caution |
Sulfuric acid | Fisher Scientific | A300 | Used for piranha solution – handle with caution |
Potassium chloride | Fisher Scientific | P335 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310 | Buffering KCl solution |
Primary Faraday cage | Shielding nanopore cell, electrodes | ||
Secondary Faraday cage | Shielding headstage, electrode wires | ||
Teflon cell | To hold nanopore chip and reservoirs | ||
Hot plate | VWR | Heating piranha solution |