Däggdjurs integument innehåller lösningsmedels extraherbara lipider som kan ge kemisk kompositioner karakteristisk för enskilda arter. Detta dokument presenterar en rutinmetod för att separera breda klasser lipid som isolerats från Integumentary vävnader med användning av tunnskiktskromatografi och bestämma triacylglyceride profilen genom matrisassisterad laserdesorption / jonisering time-of-flight mass spectrometry.
Däggdjurs integument innefattar talgkörtlar som utsöndrar ett oljigt material på hudytan. Talg produktionen är en del av det medfödda immunförsvaret som skyddar mot sjukdomsalstrande mikrober. Onormal talgproduktionen och kemiska sammansättning är också en kliniska symtom på vissa hudsjukdomar. Talg innehåller en komplex blandning av lipider, inklusive triacylglycerider, vilket är artspecifik. De allmänna kemiska egenskaper som uppvisas av olika lipidklasser hindra specifik bestämning av sebum kompositionen. Analysmetoder för lipider kräver normalt kemiska derivatiseringar som är arbetsintensiva och provberednings kostnaderna ökar. Detta dokument beskriver hur du extrahera lipider från däggdjur integument, separata breda lipidklasser genom tunnskiktskromatografi, och profilera de triacylglyceride innehållet med hjälp av matris-assisterad laser desorption / jonisering time-of-flight masspektrometri. Denna robusta metod möjliggör en direkt bestämningav de triacylglyceride profiler bland arter och individer, och det kan lätt tillämpas på alla taxonomisk grupp av däggdjur.
Däggdjurs integumentary vävnader omfattar epidermis, keratinösa strukturer (t.ex. hår och naglar) och exokrina körtlar. Sebaceous-typ exokrina körtlar är associerade med hårsäckar, vilka kollektivt hänvisas till som pilosebaceous enheten 1. Talgkörtlar släpper en oljig exsudat på huden yta kallas talg. Talg består till stor del av glycerolipider (t.ex. triacylglycerider [taggar]), gratis feta acyler (FFAs), sterol / vax estrar, och skvalen. Talg kemiska sammansättning är artspecifik 2. Förutom att vara en del av det medfödda immunförsvaret och ger antimikrobiell funktion 3, sebaceous lipider påverka viktiga fysiologiska processer, inklusive evaporativ vattenförlust genom huden 4, cellulär integritet och genreglering 5, och läkemedelsabsorptionen 6. Sebaceous lipidkompositioner kan också fungera som sjukdomsmarkörer. Förändrade förhållanden och mängder av sebaceous bväg lipidklasser är kliniska tecken på sjukdomar som akne vulgaris 7, mjäll 8, seborroiskt eksem 8, asteatosis 9, bland annat 10. Epidermala och hår vävnader ingår variabla profiler som innehåller sterol och derivat, taggar, ffas, ceramider, fosfolipider och andra mindre lipid komponenter. Eftersom Integumentary lipider kan fungera i sjukdomsprocesser, bestämma skillnader i kemiska kompositioner av TAGs mellan friska och sjuka individer kan vara användbart för klinisk diagnos av sjukdom.
Lipider är i allmänhet definieras som vattenolösliga organiska föreningar med antingen icke-polär eller icke-polär-polära substituenter 11. Lipid strukturer kan vara långa kolvätekedjor, oxygenerade alkaner (inklusive vaxestrar, FFAs, alkoholer, ketoner och aldehyder), eller komplexa ringstrukturer såsom kolesterol 12. Det finns åtta stora klasser av lipider som bygger på strukturen (FFAs, glycerolipids [GL], glycerofosfolipider [GP], sfingolipider [SP], sterol lipider [ST], prenol lipider [PR], saccharolipids [SL] och polyketider [PK]), vilka uppvisar ett brett spektrum av kemiska egenskaper beroende på klass 13. På grund av den stora variationen i de kemiska egenskaperna hos lipid klasser, är direkt profilering utan derivatisering av lipidmolekyler önskas. En emergent metod lipidforskning är tunnskiktskromatografi (TLC) i kombination med matrisassisterad laserdesorption / jonisering time-of-flight-masspektrometri (MALDI-TOF MS) 14.
MALDI-TOF-MS används flitigt i proteomic forskning för att identifiera proteiner och associera dem till specifika aminosyrasekvenser på grund av de mycket exakta peptid ion mass "fingeravtryck" som genereras från trypsin-digererade proteiner 15. MALDI-TOF-MS kan också användas för att profilera andra biomolekyler klasser, inklusive lipider såsom Triacylglyceroler 16-18. MALDI kräver användning av en matris, typtiskt en organisk förening som innehåller aromatiska och konjugerat dubbelbindningsstrukturer. Matris molekyler tjänar till att försiktigt överföra energin hos lasern till de analyter, främja protonöverföring, och producera enkelladdade gasfas joner 19-21. Joner kastas ett högspänningsfält under högvakuum och accelereras in i en TOF-massanalysator där jonerna separeras därefter genom skillnader i hastigheter som är proportionella mot deras mass-till-laddningsförhållanden. Även mycket stora biomolekyler kan joniseras med lite fragmentering, som producerar ensamma laddade molekylär jon arter för förenklad spektrumanalys. Förmågan att analysera lipidmolekyler direkt utan derivatisering har främjat redo antagande av MALDI-TOF MS i lipidomic forskning 18.
Denna uppsats presenterar en rutinmetod för att isolera och analysera integumentary lipider från håret, sebaceous sekret och plagiopatagium i östra röda bat (Lasiurus borealis). Detta används för att fastställa interspecifika variationer i bat integumentary lipider för att belysa sjukdomsprocess Vit-näsa syndrom (WNS) 22. WNS är en svampsjukdom på fladdermöss och orsakas av de nyligen beskrivna psykrofila arter Geomyces destructans 23-25. WNS har orsakat döden av över 5 miljoner nordamerikanska grotta fladdermöss och hotar utrotning av känsliga fladdermusarter, med potentiella ekonomiska konsekvenser av miljarder dollar i skador på jordbruket 26,27. För att undersöka stegen i G. destructans infektion, var lipider utvinns ur hår och ving vävnader i östra röda fladdermöss och separeras i breda lipidklasser med TLC att isolera TAG fraktionen för efterföljande analys av MALDI-TOF MS. Taggar innehåller korta acylkedjor och är lätt upptäcks av MALDI-TOF MS med liten matrisstörningar.
Denna uppsats presenterar en enkel och robust metod för att separera breda klasser lipid isolerade från däggdjurs integument med preparativ TLC och bestämma TAG profiler genom MALDI-TOF MS, utan tidsödande derivatisering av lipidmolekyler. De kritiska steg i produktion av kvalitets spektra av Triacylglyceroler med MALDI-TOF MS inkluderar: 1) Framgångsrika extrahering av föreningen med minimal nedsmutsning eller oxidation, 2) Tillräcklig separation och isolering genom kromatografi, och 3) Hög upplösning och mass noggrannhet med MALDI-TOF MS.
Detta dokument visar metoden genom att extrahera och separera neutrala lipidfraktion från plagiopatagium i östra röda bat att få TAG MS-profiler. Även om föreliggande studie använde en fladdermus arter (Mammalia: Chiroptera) Dessa metoder kan utökas för att studera Integumentary lipiderna i vilken däggdjursart som helst. Bat integument kännetecknas av att vara övervägande kolesterol, med mindre mängder TAGs, ffas, squaLene och sterol / vaxestrar. Talg lipid i fladdermöss skiljer sig från människor i det skvalen finns i små mängder (i motsats till upp till 16% hos människa), medan kolesterol sker i större förhållanden (1-7% hos människor, men 26-62% av fladdermöss) 22 , 31. Mänskliga hår innehåller ca 3% TAGs, medan förhållanden upp till 28% finns i östra röd fladdermus hår. Utvinningen av lipid prover från fladdermöss är liknande för andra arter. Även i denna studie bomullstussar indränkta i lösningsmedel används för att avlägsna sebum, kan man också invertera en flaska eller provrör innehållande lösningsmedlet på ytan av integument flera gånger. Specialiserade bandprodukter ger också alternativa sätt att utvinna yt lipider 32. En kritisk del av en ordentlig lipidextraktion är att minimera föroreningar från hudfett. Detta ordnar du enkelt genom att hålla en sprutflaska med metanol och spraya alla glas och bestick, torka redskap med en vävnad mellan alla prover och bär undersökningshandskar. Oxidation of fleromättade acyler förhindras genom tillsats av BHT, och det bör användas oavsett temperatur prover förvaras vid.
Biomolecule analys kräver vanligtvis ett kromatografiskt steg för att separera molekyler av intresse från föroreningar. TLC användes i denna metod, vilket undviker instrumenterings krav för gas-eller vätskekromatografi och kräver mindre teknisk erfarenhet för att uppnå stabila och repeterbara resultat. Beroende på lipid klassen av intresse, kan många olika mobila faser införlivas. Vidare kan användning av HPTLC-plattor och scanning densitometri användas för att åstadkomma kvantitativa resultat. Även om variationerna av TLC-metoder är för många för att räkna upp här, några vanliga mobila faser som användes i lipid TLC inkluderar kloroform: metanol: vatten för separation av fosfolipider och glykolipider eller isooktan: etyleter för separation av icke-polära lipider 28. När det gäller att separera taggar från andra lipid klasser, H: E: A sålvent systemet fungerar konsekvent och ger jämförbara resultat.
En annan fördel för att använda TLC är att band av intresse kan snabbt profileras med hjälp av MALDI-TOF MS utan derivatisering av analyterna. I denna studie kiseldioxiden avlägsnas från TLC-plattan, och analyten elueras från det genom ultraljudsbehandling i ett lösningsmedel och efterföljande centrifugering för att separera adsorbenten och indunstning av elueringsmedlet. Alternativt kan matrisen appliceras direkt på analyt band separerades på TLC-plattor och analyserades sedan direkt med MALDI-TOF-MS-33. Framgångsrik profilering av MALDI-TOF MS förlitar sig på tillräcklig provberedning och operatörens skicklighet med avstämning och kalibrering av instrumentet. Instrumentet bör kalibreras dagligen med standarder för viktområde lämpliga molekyl för molekyler av intresse. Den lämplig känslighet och upplösning (t.ex. ≥ 10000) av produkter bör också confirmed dagligen med ACTH.
Sebaceous lipidbeståndsdelarna som finns på ytan av däggdjurs integument kan spela en roll i koloniseringen av bakterier / svamp patogener. Därför är kunskap om den kemiska sammansättningen mellan arter och individer kan ge ledtrådar om processer av människor och djur sjukdomar. Intraspecifika skillnader mellan sjuka och friska individer kan representera kliniska tecken som stöd i upptäckt och diagnos sjukdom. Dessutom, om specifika föreningar som hämmar mikrobiell tillväxt är närvarande, dessa kan identifieras för användning vid behandling och förebyggande av sjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
Stöd gavs av Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony Lamark James, Amy Fischer, Hannah Blair, och Cheyenne Gerdes under utvecklingen av laboratoriemetoder. Vi vill tacka Medina-Bolivar Laboratory (Luis H. Nopo-Olazabal, Arkansas Biosciences Institute) för hjälp med TLC-scanning densitometri. MALDI-TOF MS används för detta projekt lämnades genom NSF EPSCoR, RII: Arkansas ASSET Initiative P3 Center (EPS-0.701.890) i Arkansas Biosciences Institute. Finansieringen kom från en amerikansk fiske och Wildlife Service / Arkansas State Wildlife Grant, National speleologiska Society, och Centrum för nordamerikanska Bat forskning och bevarande vid Indiana State University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals, LLC | 101162 | www.mpbio.com |
TLC Flexible Plates | Whatman | 4410-222 | www.whatman.com |
ACTH | Sigma-Aldrich Chem. Co. | A8346-5X1VL | www.sigmaaldrich.com |
Triolein | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 44895-U | |
TLC Lipid Standard | TLC 18-1 | www.nu-chekprep.com | |
MALDI TAG Standard | Nu-Check Prep., Inc. | NIH Code 53B | |
MALDI TAG Standard | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 17810-1AMP-S | |
Glass Vials with Teflon Cap | U.S. National Scientific Co. | B7800-2 | www.nationalscientific.com/ |
DHB | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 50862-1G-F | |
CHCA | Sigma-Aldrich Chem. Co. | C8982-10X10 mg | |
Sebutape | CuDerm | S100 |