포유류의 외피는 개별 종의 화학 성분 특성을 제공 할 수있는 용매 추출 지질이 포함되어 있습니다. 이 논문은 박막 크로마토 그래피를 사용하여 외피 조직으로부터 격리 광범위한 지질 클래스 분리 및 매트릭스 – 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분광 분석에 의해 triacylglyceride 프로파일을 결정하기위한 통상적 인 방법을 제시한다.
포유 동물의 외피는 피부 표면에 유성 물질을 분비하는 피지선이 포함되어 있습니다. 피지 생산은 병원성 미생물에 대한 보호이다 타고난 면역 시스템의 일부입니다. 비정상 피지 생성 및 화학 조성물은 또한 특정 피부 질환의 임상 증상이다. 피지는 종 특이하다 triacylglycerides 포함 지질의 복잡한 혼합물이 포함되어 있습니다. 다양한 지질 클래스에 의해 전시 된 다양한 화학적 특성 피지 조성물의 특정 결정을 방해. 지질에 대한 분석 기법은 일반적으로 노동 집약적 증가 샘플 준비 비용 있습니다 화학 유도체 화를 필요로한다. 이 논문은 박층 크로마토 포유류 외피, 분리 광범위한 지질 클래스로부터 지질을 추출하고, 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분석계를 사용 triacylglyceride 내용을 프로파일 링하는 방법을 설명합니다. 이 강력한 방법은 직접 측정 할 수종 및 개인간 triacylglyceride 프로파일, 그리고 용이 포유류의 임의의 분류 학적 그룹에 적용 할 수있다.
포유류의 외피 조직은 표피 각질 구조 (예를 들어, 머리와 손톱), 및 외분비 샘이 (가) 있습니다. 피지선 형 외분비 샘은 공동으로 좌창 부 (1)이라고합니다 모낭과 연결되어 있습니다. 피지선은 피지이라 피부 표면에 기름 삼출물을 놓습니다. 피지는 glycerolipids (예 triacylglycerides [태그]), 유리 지방산의 acyls (유리 지방산), 스테롤 / 왁스 에스테르, 스쿠알렌으로 주로 구성되어있다. 피지의 화학적 조성은 종 특이이있다. 선천성 면역계의 일부인 및 항균 기능 3을 제공 할뿐만 아니라, 지질, 피부 피지선 4까지 증발 수분 손실, 셀룰러 무결성 및 유전자 조절 (5) 및 약물 흡수 6 등 중요한 생리 학적 과정에 영향을 미친다. 피지 지질 조성물은 질환의 마커 역할을 할 수 있습니다. 변경 비율 및 피지선 (B)의 양도로 지질 클래스는 다른 사람 (10) 사이에 여드름 7, 8 비듬, 지루성 피부염 8 asteatosis 9, 같은 질병의 임상 증상입니다. 표피와 헤어 조직 스테롤 및 파생 상품, 태그, 유리 지방산, 세라마이드, 인지질 및 기타 사소한 지질 성분을 함유 변수 프로파일을 포함한다. 외피 지질, 질병 프로세스에서 작동 할 수 있기 때문에 건강하고 병에 걸린 사람 사이의 태그의 화학 성분의 차이를 결정하는 것은 질병의 임상 진단에 유용 할 수 있습니다.
지질은 일반적으로 비극성 또는 하나 비극성 극성 치환체 (11)와 불용성 유기 화합물로 정의된다. 지질 구조체가 긴 탄화수소 사슬 (왁스 에스테르, 유리 지방산, 알콜, 케톤, 알데히드 등) 산소화 알칸, 또는 콜레스테롤 (12)과 같은 복잡한 고리 구조 일 수있다. 구조를 기반으로 지질의 주요 8 클래스 (유리 지방산, glycerolipi이 있습니다DS [GL] glycerophospholipids에 따라 화학적 특성의 다양한 전시 [GP], 스핑 고리 피드 [SP], 스테롤 지질 [ST], 프레 놀 지질 [PR] saccharolipids [SL] 및 polyketides [PK), 클래스 13. 때문에 지질 클래스의 화학적 특성의 폭 넓은 변화에 지질 분자의 사전 유도체없이 직접 프로파일이 요구되고있다. 지질 연구 한 출사 방법은 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분석 (MALDI-TOF MS) (14)와 결합하여 박층 크로마토 그래피 (TLC)이다.
MALDI-TOF MS는 단백질을 식별하고 인해 트립신 소화 단백질 (15)로부터 생성 된 매우 정확한 펩타이드 이온 질량 "지문"을 특정 아미노산 서열에 연결하는 단백체 연구에서 광범위하게 사용된다. MALDI-TOF MS는 또한 태그 16-18과 같은 지질을 포함하는 다른 생체 분자 클래스를 프로파일 링하는 데 이용 될 수있다. MALDI는 행렬, 일반의 사용을 필요방향족과 공액 이중 결합 구조를 포함하는 유기 화합물을 ically. 매트릭스 분자는 온화, 분석 물에 레이저 에너지를 전달 양성자 전달을 촉진하고, 단독 청구 가스상 19-21 이온을 생성하는 역할을한다. 이온은 고 진공하에 높은 전압 필드를 실시하고 이온이 연속적 그들의 질량 대 전하 비율에 비례하는 속도 차이에 의해 분리된다 TOF 질량 분석기로 가속된다. 심지어 매우 큰 생체 분자 간략화 스펙트럼 분석을위한 단독 청구 분자 이온 종을 생산, 작은 조각으로 이온화 될 수있다. 이전 유도체 화하지 않고 직접 지질 분자를 분석 할 수있는 능력은 lipidomic 연구 18 MALDI-TOF MS의 준비 채택을 추진하고있다.
이 논문은 머리에서 외피 지질을 분리하고 분석 할 수있는 일상적인 방법을 제시, 피지 분비와 동부 붉은 박쥐의 plagiopatagium (Lasiurus boreali들). 이것은 화이트 코 증후군 (WNS) (22)의 질병 과정을 설명하기 위하여 박쥐 외피 지질의 종간의 차이를 확인하는 데 사용됩니다. WNS는 박쥐의 곰팡이 질환과 Geomyces가 23-25 destructans 새로 설명 호냉 종에 의해 발생합니다. WNS는 5 백만 북미 동굴 박쥐의 죽음의 원인 및 농업 산업 (26, 27)에 손상 수십억 달러의 잠재적 인 경제적 영향과 취약 박쥐 종의 멸종을 위협하고있다. G.의 단계를 조사하려면 감염 destructans, 지질은 동부 붉은 박쥐의 머리와 날개 조직에서 추출하고, MALDI-TOF MS에 의한 후속 분석을 위해 태그 부분을 분리하기 위해 TLC에 의해 광범위한 지질 클래스로 구분됩니다. 태그는 짧은 아실 체인을 포함하고 쉽게 작은 매트릭스 간섭 MALDI-TOF MS에 의해 감지됩니다.
이 논문은 지질 분자의 시간이 소요되는 유도체 화하지 않고, 예비 TLC에 의해 포유 동물의 외피 분리 광범위한 지질 클래스를 분리 MALDI-TOF MS에 의해 TAG 프로파일을 결정하기위한 간단하고 강력한 방법을 제공합니다. MALDI-TOF MS와 태그의 품질의 스펙트럼을 생산하는 중요한 단계는 다음과 같습니다 최소한의 오염이나 산화를 가진 화합물 1) 성공적인 추출, 크로마토 그래피에 의한 2) 충분한 분리 및 격리하고, MALDI-TOF 3) 해상도와 질량 정확성을 MS.
이 논문은 TAG MS 프로파일을 얻기 위해 동부 붉은 박쥐의 plagiopatagium에서 중성 지질 부분을 추출하고 분리하여 방법을 보여줍니다. 본 연구는 박쥐 종 사용하는 동안 (포유 :보기 Chiroptera)이 방법은 모든 포유 동물 종의 외피 지질을 연구하기 위해 확장 할 수 있습니다. 박쥐 외피는 태그, 유리 지방산, squa의 낮은 금액으로, 주로 콜레스테롤 것을 특징으로렌 및 스테롤 / 왁스 에스테르. (- 인간의 7 % 만 26 – 1 박쥐의 62 %) 콜레스테롤이 더 큰 비율로 발생하는 동안 박쥐 피지의 지질 비율이 그 스쿠알렌에 인간과 다른 것은, (인간의 최대 16 % 반대) 낮은 양으로 존재하다 22 31. 28 %까지의 비율이 동부 붉은 박쥐의 머리에서 발견하는 동안 인간의 머리카락은 약 3 %의 태그가 포함되어 있습니다. 박쥐에서 지질 샘플의 추출은 다른 종과 유사하다. 이 연구에서, 용매에 담가 면봉은 피지를 제거하기 위해 사용되는 반면, 하나는 여러 번 외피의 표면에 용제를 함유하는 바이알 또는 샘플 튜브를 반전 할 수있다. 특수 테이프 제품은 표면 지질 32를 추출하는 대체 수단을 제공한다. 적절한 지질 추출의 중요한 부분은 피부 오일의 오염을 최소화하는 것입니다. 이것은 쉽게 모든 샘플 및 입고 검사 장갑 사이의 조직과기구를 닦고, 메탄올로 스퀴즈 병을 유지하고 모든 유리 식기를 분사하여 수행됩니다. 산화 오F는 불포화 acyls BHT의 추가를 통해 방지하고 불문 샘플에 저장된 온도의 사용되어야한다.
생체 분자 분석은 일반적으로 오염 물질의 관심의 개별 분자 크로마토 그래피 단계가 필요합니다. TLC는 가스 나 액체 크로마토 그래피에 대한 계측 요구 사항을 방지하고 견고하고 반복 가능한 결과를 달성하기 위해 덜 기술적 인 경험을 필요로이 방법에 사용됩니다. 또한 지질 수준에 따라 여러 가지 이동상은 통합 될 수있다. 또한, HPTLC 플레이트 및 주사 농도계의 사용은 정량적 결과를 얻기 위해 사용될 수있다. TLC 방법의 변화가 너무 많아서 여기에 모두 나열 할 수 있지만, 지질 TLC에 사용되는 몇 가지 일반적인 모바일 단계 클로로포름을 포함한다 : 비극성 지질 (28)의 분리를위한 에틸 에테르 : 메탄올 : 인지질 및 당지질 또는 이소옥탄의 분리를위한 물. E : 다른 지질 클래스, H에서 태그를 분리의 측면에서 너무lvent 시스템이 지속적으로 작동하고 비교 결과를 제공합니다.
TLC를 사용하는 또 다른 장점은 그 밴드 빠르게 분석 물질의 유도체 화 전에없이 MALDI-TOF MS를 이용하여 프로파일 링 될 수 있다는 것이다. 본 연구에서는 실리카 TLC 플레이트로부터 제거되고, 분석 물질은 용출 용매의 증발 및 흡착제를 분리하는 용매 및 이후 원심 분리에 초음파로부터 용출된다. 또한, 매트릭스 분석 밴드 TLC 플레이트에서 분리 한 다음 직접 MALDI-TOF MS (33)에 의해 분석에 직접 적용 할 수있다. MALDI-TOF MS에 의해 성공적으로 프로파일 링은 충분한 샘플 준비 및 튜닝 및 계측기를 교정와 운영자의 능력에 의존 않습니다. 악기는 그 분자 분자량 범위의 적절한을 다루는 표준을 매일 교정해야한다. 장비의 적절한 감도와 해상도 (예 : ≥ 10,000)도 confirme에해야ACTH 매일 거라고.
포유 동물의 외피의 표면에서 발견 피지의 지질 성분은 세균 / 곰팡이 병원균에 의해 식민지에 역할을 할 수 있습니다. 따라서 종 및 개인 간의 화학적 조성물의 기술은 인간 및 동물 질병의 프로세스에 대한 실마리를 제공 할 수있다. 질병과 건강한 사람 사이에 종자 간 차이가 임상 증상을 나타낼 수 있다는 질병 감지 및 진단에 도움. 미생물 성장을 억제하는 특정 화합물이 존재하는 경우 또한, 이러한 질환 치료 및 예방에 사용하기 위해 식별 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
지원은 실험 방법의 개발 기간 동안 스콧 Treece, Katelyn Arter, 제레미 Ragsdell, 토니 LaMark 제임스, 에이미 피셔, 한나 블레어, 그리고 샤이엔 GERDES에 의해 제공되었다. TLC 스캔 농도계에 대한 지원을 위해, 우리는 메디나 후에 연구소 (아칸소 생명 과학 연구소 루이스 H. 노포 – Olazabal)에 감사의 말씀을 전합니다. 아칸소 생명 과학 연구소에서 아칸소 자산 이니셔티브 P3 센터 (EPS-0701890) : MALDI-TOF MS는이 프로젝트에 사용되는은 NSF EPSCoR 해당, RII를 통해 제공되었다. 기금은 미국의 수산 동물 서비스 / 아칸소 주 야생 동물 그랜트, 국립 동굴 학 사회, 인디애나 주립 대학에서 북미 박쥐 연구 및 보존을위한 센터에 의해 제공되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals, LLC | 101162 | www.mpbio.com |
TLC Flexible Plates | Whatman | 4410-222 | www.whatman.com |
ACTH | Sigma-Aldrich Chem. Co. | A8346-5X1VL | www.sigmaaldrich.com |
Triolein | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 44895-U | |
TLC Lipid Standard | TLC 18-1 | www.nu-chekprep.com | |
MALDI TAG Standard | Nu-Check Prep., Inc. | NIH Code 53B | |
MALDI TAG Standard | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 17810-1AMP-S | |
Glass Vials with Teflon Cap | U.S. National Scientific Co. | B7800-2 | www.nationalscientific.com/ |
DHB | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 50862-1G-F | |
CHCA | Sigma-Aldrich Chem. Co. | C8982-10X10 mg | |
Sebutape | CuDerm | S100 |