Mammalian integument indeholder opløsningsmiddel-ekstraherbare lipider, der kan give kemiske sammensætninger karakteristisk for de enkelte arter. Dette dokument viser en rutinemæssig fremgangsmåde til adskillelse brede lipidklasser isoleret fra integumentary væv ved anvendelse af tyndtlagskromatografi og bestemmelse af triacylglycerid profil ved matrix-assisteret laser desorption / ionisering time-of-flight massespektrometri.
Pattedyrs integument omfatter talgkirtler, der udskiller et olieagtigt materiale på hudoverfladen. Talgproduktion er en del af det medfødte immunsystem, der er beskyttende mod patogene mikrober. Unormal talgproduktion og kemiske sammensætning er også et klinisk symptom på særlige hudsygdomme. Sebum indeholder en kompleks blanding af lipider, herunder triacylglycerider, som er artsspecifik. De brede kemiske egenskaber, som udvises af forskellige lipidklasser hindre den specifikke bestemmelse af sebum sammensætning. Analytiske teknikker til lipider kræver typisk kemiske derivatiseringer der er arbejdskrævende og øge prøveforberedelse omkostninger. Dette papir beskriver, hvordan man udtrække lipider fra pattedyr integument, separate brede lipidklasser ved tyndtlagskromatografi, og profilere triacylglycerid indhold ved hjælp af matrix-assisteret laser desorption / ionisering tid-of-flight massespektrometri. Denne robuste metode muliggør en direkte bestemmelseaf triacylglycerid profiler blandt arter og individer, og det let kan anvendes på enhver taksonomiske gruppe af pattedyr.
Pattedyrs integumentary væv omfatter overhuden, keratinholdigt strukturer (f.eks hår og negle), og eksokrine kirtler. Sebaceous-type eksokrine kirtler er forbundet med hårsække, som er kollektivt benævnt hårtalgenheden 1.. Talgkirtlerne frigive en fedtet ekssudat på huden overflade kaldet sebum. Sebum består hovedsagelig af glycerolipider (f.eks triacylglycerider [TAG]), gratis fede acyler (FFA'ere), sterol / voksestere og squalen. Sebum kemiske sammensætning er artsspecifik 2. Ud over at være en del af det medfødte immunsystem og give antimikrobiel funktion 3, sebaceous lipider berøre vigtige fysiologiske processer, herunder fordampningsemissioner vandtab gennem huden 4, cellulær integritet og genregulering 5, og lægemiddelabsorptionen 6. Sebaceous lipidsammensætninger kan også tjene som markører for sygdomme. Altered nøgletal og mængder af sebaceous Broad lipidklasser er kliniske tegn på sygdomme, såsom acne vulgaris 7, skæl 8, seborrheic dermatitis 8, asteatosis 9, blandt andre 10. Epidermale og hår væv omfatter variable profiler, sterol og derivater, tags, FFA, ceramider, phospholipider og andre mindre lipid komponenter. Fordi integumentary lipider kan fungere i sygdom processer, bestemme forskelle i kemiske sammensætninger i TAG mellem raske og syge individer kan være nyttige for klinisk diagnose af sygdom.
Lipider er generelt defineret som vanduopløselige organiske forbindelser med enten polær eller ikke-polær-polære substituenter 11. Lipidstrukturer kan være lange carbonhydridkæder, oxygenerede alkaner (inklusive voksestere, FFA, alkoholer, ketoner og aldehyder), eller komplekse ringstrukturer såsom cholesterol 12. Der er otte store klasser af lipider baseret på struktur (FFA'ere, glycerolipids [GL] glycerophospholipider [GP], sphingolipider [SP], sterol lipider [ST], prenol lipider [PR], saccharolipids [SL] og polyketider [PK]), som udviser en bred vifte af kemiske egenskaber afhængigt af klasse 13. På grund af den store variation i de kemiske egenskaber af lipidklasser, ønskes direkte profilering uden forudgående derivatisering af lipid molekyler. En emergente fremgangsmåde lipid forskning er tyndtlagskromatografi (TLC) kombineret med matrix-assisteret laser desorption / ionisering time-of-flight massespektrometri (MALDI-TOF MS) 14.
MALDI-TOF MS er udbredt i proteom forskning for at identificere proteiner, og knytte dem til specifikke aminosyresekvenser på grund af de meget præcise peptid ionmasse "fingeraftryk" genereret fra trypsin-fordøjede proteiner 15. MALDI-TOF MS kan også bruges til at profilere andre biomolekyler klasser, herunder lipider, såsom TAG 16-18. MALDI kræver brug af en matrix, typtisk en organisk forbindelse, der indeholder aromatiske og konjugerede dobbeltbinding strukturer. De matrixmolekyler tjener til forsigtigt at overføre energi af laseren med analytterne, fremmer protonoverførsel og frembringe enkeltvis ladede gasfase-ioner 19-21. Ioner udsættes for en høj spænding felt under højvakuum og accelereret i en TOF massespektrometer hvor ioner adskilles efterfølgende af forskelle i hastigheder, som er proportional med deres masse-til-ladningsforhold. Selv meget store biomolekyler kan ioniseret med lidt fragmentering, der producerer enkeltvis ladede molekylære ion arter for forenklet spektrum analyse. Evnen til at analysere lipid molekyler direkte uden forudgående derivatisering har fremmet klar vedtagelse af MALDI-TOF MS i lipidomic forskning 18.
Denne artikel præsenterer en rutinemæssig metode til at isolere og analysere integumentary lipider fra håret, sebaceous sekreter og plagiopatagium af det østlige røde bat (Lasiurus borealis). Dette bruges til at bestemme artskrydsede variationer i bat integumentary lipider at belyse sygdommen proces White-næse syndrom (WNS) 22. WNS er en svampesygdom flagermus og er forårsaget af de nyligt beskrevne psykrofile arter Geomyces destructans 23-25. WNS har kostet mere end 5 millioner nordamerikanske grotte flagermus og truer udryddelsen af sårbare flagermusarter med eventuelle økonomiske konsekvenser af milliarder af dollars i skader på landbruget 26,27. For at undersøge de trin i G. destructans infektion blev lipider ekstraheret fra hår-og fløj væv af østlige røde flagermus og opdelt i brede lipidklasser ved TLC at isolere TAG fraktion for efterfølgende analyse af MALDI-TOF MS. TAG indeholder korte acylkæder og er let afsløres ved MALDI-TOF MS med lidt matrix interferens.
Denne artikel præsenterer en enkel og robust metode til adskillelse brede lipidklasser isoleret fra pattedyr integument ved præparativ TLC og bestemme TAG profiler ved MALDI-TOF MS, uden tidskrævende derivatisering af lipid molekyler. De kritiske trin i at producere kvalitet spektre af TAG med MALDI-TOF MS omfatter: 1) Vellykket udvinding af forbindelsen med minimal forurening eller oxidation, 2) Tilstrækkelig adskillelse og isolation ved kromatografi, og 3) Høj opløsning og masse nøjagtighed ved MALDI-TOF MS.
Dette papir demonstrerer metoden ved at udtrække og adskillelse af den neutrale lipidfraktion fra plagiopatagium i den østlige røde bat til at opnå TAG MS Profiler. Mens denne undersøgelse brugte en flagermusarter (Mammalia: CHIROPTERA) disse metoder kan udvides til at studere integumentary lipider eventuelle pattedyrarter. Bat integument er karakteriseret ved at være overvejende kolesterol, med lavere mængder af TAG, FFAs, squaLene og sterol / voksestere. Sebum lipidforhold i flagermus afviger fra mennesker i at squalen er til stede i små mængder (i modsætning til op til 16% i mennesker), mens kolesterol forekommer i større forhold (1 – 7% i mennesker, men 26 til 62% i hunde) 22 31. Menneskelige hår indeholder omkring 3% TAG, mens nøgletal op til 28% er fundet i det østlige rødt bat hår. Udvindingen af lipid prøver fra flagermus er den samme for andre arter. Selv i denne undersøgelse vatkugler dyppet i opløsningsmiddel anvendes til at fjerne sebum, kan man også vendes et hætteglas eller en prøverør indeholdende opløsningsmiddel på overfladen af integument flere gange. Specialiserede tape produkter også giver alternative muligheder for at udtrække overflade lipider 32.. En kritisk del af en ordentlig lipidekstraktion er at minimere forurening fra hud olier. Dette opnås let ved at holde et squeeze flaske med methanol og sprøjtning alle glas og køkkenredskaber, aftørring redskaber med en serviet mellem alle prøver og iført undersøgelse handsker. Oxidation of polyumættede acylgrupper forhindres ved tilsætning af BHT, og det bør anvendes uanset temperaturen prøver opbevares ved.
Biomolekyler analyse kræver normalt en kromatografisk skridt til at adskille molekyler af interesse fra forureninger. TLC anvendes i denne fremgangsmåde, som undgår instrumentering krav til gas-eller væskekromatografi og kræver mindre teknisk erfaring for at opnå solide og reproducerbare resultater. Afhængigt af lipid klasse af interesse, kan mange forskellige mobile faser inkorporeres. Endvidere kan brugen af HPTLC plader og scanningsdensitometri anvendes til at opnå kvantitative resultater. Mens variationer af TLC metoder er for talrige til at nævne her, nogle fælles mobile faser, der anvendes i lipid TLC omfatter chloroform: methanol: vand til separation af phospholipider og glycolipider eller isooctan: ethylether til adskillelse af ikke-polære lipider 28. Med hensyn til at adskille tags fra andre lipidklasser, H: E: A sålvent system fungerer konsekvent og giver sammenlignelige resultater.
En anden fordel for at bruge TLC er, at bands af interesse hurtigt kan profileres ved hjælp af MALDI-TOF MS uden forudgående derivatisering af analytter. I denne undersøgelse silica fjernes fra TLC-pladen, og analytten elueret fra det ved sonikering i et opløsningsmiddel og efterfølgende centrifugering for at adskille adsorbenten og afdampning af elueringsopløsningsmidlet. Alternativt kan der anvendes matrix direkte på analyt bånd adskilt på TLC-plader og derefter analyseret direkte ved MALDI-TOF-MS 33. Vellykket profilering ved MALDI-TOF MS er afhængig af tilstrækkelig prøveforberedelse og operatørens færdigheder med tuning og kalibrering af instrumentet. Instrumentet bør kalibreres dagligt med standarder, der dækker molekylvægtinterval hensigtsmæssigt for molekyler af interesse. Den passende følsomhed og opløsning (fx ≥ 10.000) af udstyret bør også confirmed dagligt med ACTH.
Sebaceous lipidbestanddele findes på overfladen af pattedyr integument kan spille en rolle i kolonisering af bakterielle / svampepatogener. Derfor kendskab til den kemiske sammensætning blandt arter og individer kan give fingerpeg om processer menneskelige og dyreliv sygdomme. Intraspecifikke forskelle blandt syge og raske personer kan repræsentere kliniske tegn, at støtte i påvisning og diagnosticering sygdom. Desuden, hvis specifikke forbindelser, som inhiberer mikrobiel vækst er til stede, kan disse identificeres til anvendelse i behandling og forebyggelse af sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Assistance blev leveret af Scott Treece, Katelyn Arter, Jeremy Ragsdell, Tony Lamark James, Amy Fischer, Hannah Blair, og Cheyenne Gerdes under udviklingen af laboratoriemetoder. Vi vil gerne takke Medina-Bolivar Laboratory (Luis H. NOPO-Olazabal, Arkansas Biosciences Institute) for at få hjælp med TLC scanningsdensitometri. MALDI-TOF MS bruges til dette projekt blev givet gennem NSF EPSCoR, RII: Arkansas ASSET Initiative P3 Center (EPS 0.701.890) i Arkansas Biosciences Institute. Finansieringen blev leveret af en amerikansk Fiskeri og Wildlife Service / Arkansas State Wildlife Grant, National speleologiske Society og The Center for nordamerikanske Bat forskning og bevaring på Indiana State University.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals, LLC | 101162 | www.mpbio.com |
TLC Flexible Plates | Whatman | 4410-222 | www.whatman.com |
ACTH | Sigma-Aldrich Chem. Co. | A8346-5X1VL | www.sigmaaldrich.com |
Triolein | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 44895-U | |
TLC Lipid Standard | TLC 18-1 | www.nu-chekprep.com | |
MALDI TAG Standard | Nu-Check Prep., Inc. | NIH Code 53B | |
MALDI TAG Standard | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 17810-1AMP-S | |
Glass Vials with Teflon Cap | U.S. National Scientific Co. | B7800-2 | www.nationalscientific.com/ |
DHB | Sigma-Aldrich Chem. Co. | 50862-1G-F | |
CHCA | Sigma-Aldrich Chem. Co. | C8982-10X10 mg | |
Sebutape | CuDerm | S100 |