Мотор Перерезка нерва и Покадровый Визуализация глиальных клеточных поведений в Живом данио рерио

Данио рерио широко используются для изучения развития нервной системы, потому что их оптических прозрачность и легкость трансгенеза, что в сочетании, позволяют захватывающий визуализации динамических характеристик ячейки в живом эмбриона. Кроме того, поскольку данио рерио и млекопитающих делать почти все гены, необходимые для формирования нервной системы, клеточные и молекулярные информация, собранная в этой модели организм непосредственно Relatable других видов позвоночных. Несмотря на невероятно мощный для нейронных исследований развития, данио а его уникальные свойства имеют потенциал, чтобы также лучше понять механизмы, которые поддерживают и восстановлению нервной системы после травмы. Данио личинки сохраняют свою прозрачность в конце личиночной стадии и пигментация может быть эффективно блокируют или использование фармакологических ингибиторов производства меланина или генетических мутантов, которые не имеют пигментных клеток. Таким образом, используя эту модель организма для изучения травм и Regeneratиона в старых животных можно и предлагает уникальную возможность непосредственно исследовать клеточные и молекулярные механизмы, которые восстановлению нервной системы. В этой рукописи, мы опишем, как эффективно и воспроизводимо повредить нервы в ПНС личинки данио. Это повреждение парадигма поддается изучению не только дегенерации, но и ответов периферической глии и иммунных клеток, а также взаимодействие между этими группами населения в процессе регенерации.

ПНС представляет собой сложную сеть моторных и сенсорных нервов, которые необходимо передавать информацию между центральной нервной системы (ЦНС) и кожи, органов и мышцы тела, что позволяет организму взаимодействовать с окружающей средой и выжить. Вдоль этих нервов, периферических глии, в том числе миелинизирующих и не миелинизирующих шванновских клеток и периневральной глии, а также соединительную ткань, упаковывают аксонов и в конечном счете образуют зрелый нерва. Повреждение этих нервов инициирует процесс KNown как Wallerian дегенерации ^10. Этот механизм аксонов фрагментации, иммунные набора, оформления и мусора регенерации очень стереотипно и генетически регулируется ^1. Предыдущие исследования в системах млекопитающих описали роль шванновских клеток в процессе дегенерации нерва и ^{1 регенерации, 2, 6, 8.} В этих исследованиях основных тканей или клеточных культур, Шванн клетки не только работу макрофагов в месте повреждения, чтобы помочь в зазор мусора, но и помогают в себя фагоцитоза миелина. Хотя эти исследования были невероятно информативным, мы никогда раньше не визуализированы глиальных ответов на повреждение периферического аксона в естественных условиях в реальном времени, и никакие другие исследования не исследовали взаимосвязь между различными классами периферической глии во время этих событий.

В последнее время несколько лабораторий исследовали Wallerian дегенерации использованием данио и лазерно-опосредованной травмы аксона подобно тому, что мы описываем здесь <sup> 4, 5, 7, 9. В некоторых из этих исследований, поверхностный сенсорных аксонов были аксотомизированных в молодые личинки использованием индивидуальному заказу, двухфотонные конфокальной микроскопии ^{4, 5, 9.} В другом исследовании, которое очень похоже на наш собственный, более глубокие аксонов в вентральной двигательного нерва были перерезаны в 5 дневных личинок с использованием коммерчески доступной системой лазерной абляции ^7. В обоих этих экспериментальных установок, акцент был сделан на Wallerian дегенерация и как аксонов и иммунные клетки были обследованы. Расширить свое присутствие на этих исследованиях, мы описываем ранив двигателя аксонов у пожилых личинки с более зрелыми, миелиновых нервы и анализа характеристик всех нервных соответствующие периферийные глии при дегенерации и регенерации.

Чтобы сделать это, мы секут двигательных нервов в 6 и 7 день после оплодотворения (DPF), личинок и визуализировать ответов отдельных глиальных населения, а также исследовать взаимодействие между этими группами населения по поврежденных аксонов. Использование двойных и тройных траnsgenic линий, которые этикетке периферийных глии, в том числе Шванн клетки и периневральной глии, а также в качестве маркера для аксонов, мы используем имеющиеся в продаже системы лазерной абляции состоящей из атома азота накачкой лазером на красителе (длина волны 435 нм), прикрепленный к вращающемуся диску конфокальной системы создать transections аксона. Это экспериментальная установка позволяет визуализировать живые, личиночной данио, ранить конкретных периферийными Мотор аксонов путей и покадровой изображения ответов различных групп населения к глиальных травмы аксонов и их связь друг с другом. Этот протокол может быть дополнительно адаптирована для создания повреждений нерва у рыбок данио разных возрастов, с разными трансгенных линий или генетических мутантов для решения различных научных вопросов.