Zebrafisk er blevet brugt i udstrakt grad til at studere udviklingen af ​​nervesystemet på grund af deres optiske transparens og lethed af transgenese, som når den kobles, tillader spektakulær billeddannelse af dynamiske celle adfærd hos et levende foster. Derudover, fordi zebrafisk og pattedyr deler næsten alle de gener, der er nødvendige for nervesystemet dannelse, cellulær og molekylær information indsamlet i denne model organisme er direkte relateres til andre hvirveldyr. Selvom utrolig kraftfuld for neurale udviklingsmæssige undersøgelser, har zebrafisk og dets unikke egenskaber potentiale til også belyse de mekanismer, der opretholder og genopbygge nervesystemet efter skade. Zebrafisk larver opretholde deres gennemskinnelighed i sene larvestadier og pigmentering effektivt kan blokeres med enten brug af farmakologisk inhibitorer af melanin produktion eller genetiske mutanter, der mangler pigment celler. Således at bruge denne model organisme studere skade og GENERATORISKion i ældre dyr er mulig og giver en unik mulighed for direkte at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer, der genopbygge nervesystemet. I dette manuskript, beskriver vi, hvordan man effektivt og reproducerbart skade nerverne i PNS af zebrafisk larver. Denne skade paradigme egner sig til at studere ikke blot degeneration, men også svarene fra perifere glia og immunceller samt samspillet mellem disse populationer under regenerering.

PNS er et komplekst netværk af motoriske og sensoriske nerver, der er nødvendig for at passere oplysninger mellem det centrale nervesystem (CNS) og huden, organer og muskler i kroppen, så en organisme til at interagere med sine omgivelser og overleve. Langs disse nerver. Perifer glia, herunder myelinerende og ikke-myelinerende Schwann-celler og perineurial glia samt bindevæv, omslutter axoner og i sidste ende danner modne nerve Skade af disse nerver indleder en proces known som Wallerian degeneration ^10.. Denne mekanisme axonal fragmentering, immun rekruttering, vragrester clearance og regenerering er meget stereotypt og genetisk reguleret ^1.. Tidligere undersøgelser i mammale systemer har beskrevet roller Schwann-celler under nerve degeneration og regeneration ^{1, 2, 6, 8.} I disse studier af fast væv eller cellekultur, ikke kun Schwann celler rekrutteret makrofager til skaden site for at hjælpe med vragdele clearance, men også hjulpet i myelin fagocytose selv. Mens disse undersøgelser har været utrolig informativ, vi har aldrig før visualiserede gliale reaktioner på perifer Axon skade in vivo i realtid, og ingen andre studier har undersøgt sammenhængen mellem de forskellige klasser af perifer glia i disse begivenheder.

Senest er flere laboratorier undersøgt Wallerian degeneration ved hjælp zebrafisk og laser-medieret Axon skade svarer til, hvad vi beskriver her <sup> 4, 5, 7, 9. I nogle af disse undersøgelser blev overfladiske sensoriske axoner axotomized i unge larver ved hjælp af en specialbygget, to-foton konfokal mikroskop ^{4, 5, 9.} I en anden undersøgelse er der meget lig vores eget, blev dybere axoner i ventrale motorisk nerve transected i 5 dage gamle larver anvendelse af et kommercielt tilgængelig laserablation systemet ^7.. I begge disse eksperimentelle set-ups, var der fokus på Wallerian degeneration og både axoner og immunceller blev afbildet. At udvide disse undersøgelser beskriver vi sårede motoriske axoner i ældre larver med mere modne, myelinerede nerver og assay respons af al nerve-associeret perifer glia under degeneration og regeneration.

For at gøre dette, vi transektere motoriske nerver i 6 og 7 dag efter befrugtning (DPF) larver og visualisere svarene enkelte gliale befolkninger samt undersøge samspillet mellem disse populationer langs tilskadekomne axoner. Brug dobbelt og tredobbelt transgenic linjer, etiket perifer glia, herunder Schwann-celler og perineurial glia, samt en markør for axoner, bruger vi en kommercielt tilgængelig laser ablation system bestående af en nitrogen-pumpet farvelaser (bølgelængde 435 nm) fastgjort til en roterende skive konfokalt systemet at skabe Axon transections. Denne eksperimentelle set-up giver os mulighed for at visualisere levende, larve zebrafisk, såre specifikke perifere motoriske Axon skrifter og time-lapse billede svarene fra forskellige gliaceller befolkninger til Axon skade og deres forhold til hinanden. Denne protokol kan tilpasses yderligere til at skabe nerve skader i zebrafisk af forskellige aldre, med forskellige transgene linier eller genetiske mutanter til at løse forskellige videnskabelige spørgsmål.