Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사
Summary
타겟이 불분명 한 대사는 대사 프로파일의 스냅 샷을 생성하는 가설을 제공합니다. 이 프로토콜은 혈청 세포 또는 조직에서 대사 산물의 추출 및 분석을 보여줍니다. 대사 산물의 범위는 액체 – 액체 상 추출을 사용하여 조사하는, 마이크로 ultraperformance 액체 크로마토 그래피 / 차동 분석 소프트웨어에 결합 고해상도 질량 분석법 (UPLC-HRMS).
Abstract
여기에서 우리는 등 그 생물 학적 샘플 신진 대사 프로파일을 분석 할 수있는 워크 플로우를 제시, 세포, 혈청, 또는 조직. 샘플을 먼저 액체 – 액체 상 적출에 의해 극성 및 비극성 분획으로 분리하고, 부분적으로 다운 스트림 분석을 용이하게 정제된다. 초기 추출 수용액 (극성 대사 물질) 및 유기 모두 (비 극성 대사 물질) 단계는 대사의 넓은 범위를 조사하기 위해 처리됩니다. 대사는 자신의 파티션 속성에 따라 다른 액체 크로마토 그래피 방법으로 구분됩니다. 이 방법에서는, 우리는 (UP) LC 방법을 마이크로 초 성과를 제시하지만, 프로토콜은 높은 흐름과 낮은 압력으로 확장됩니다. 질량 분석기에 도입 일반 또는 화합물 최적화 된 소스 조건 중 하나를 할 수 있습니다. 이온의 넓은 범위의 검출은 최근 C에 높은 해상도를 사용하여 광범위한 m / Z 범위에서 긍정적이고 부정적인 모드에서 전체 스캔 모드에서 수행됩니다악기를 alibrated. 레이블 무료 차동 분석은 생물 정보학 플랫폼에서 수행됩니다. 이 방법의 응용 프로그램은 대사 경로 검사, biomarker 발견과 약물 개발이 (가) 있습니다.
Introduction
HRMS 분야의 최근 기술 발전으로 인해, 타겟이 불분명 한, 가설 생성 대사 접근은 복잡한 시료의 분석 가능한 방법이되고 있습니다. 백만 루틴 낮은 부분을 촉진 100,000 해상도 (PPM)의 질량 정확도 수 1 질량 분석기 널리되고있다 여러 공급 업체에서 제공. 2,3이 질량 정확도는 더 특이 분석의 정체성, 동위 원소 패턴 인식, 내전 식별의 예비 할당에 대한 신뢰하실 수 있습니다. 4 적절한 추출 절차 및 고성능 LC 또는 UPLC, 복잡한 혼합물과 결합 할 때 유지 시간 데이터에서 파생 된 추가 특이성 분석 할 수 있습니다. 5 UPLC 더 큰 크로마토 그래피의 효율성을 소유하고 그 결과 큰 데이터 집합이 어떤에 통합 될 수있는 가능한 대사 체 6.의 큰 범위를 만드는 민감도, 해상도 및 분석 시간을 허용여러 개의 차동 분석 소프트웨어 및 유용한 패턴이나 관심의 개별 분석을 위해 채굴. 7,8,9,10,11 상상 속 히트 곡이 처음 피크 검출 알고리즘의 조합, 정확한 질량 기반의 화학 수식 예측, 조각 예측을 사용하여 식별 할 수있는, 그리고 화학 데이터베이스 검색을. 이 방법은 수 시간이 소요되는 전체 구조 식별을 위해 또는 더 민감하고 더 구체적인 안정 동위 원소 희석 개발을위한 목표 UPLC / 선택 또는 다중 반응 모니터링 / 정량에 대한 현재 금 표준 방법입니다 MS 연구. 12 우선 순위
생물학적 시료의 다양한 자연 뇨 13, 셀 14, 혈청 15, 또는 조직 16 추출 프로토콜 최적화되었다. 이 프로토콜 기능을 추출 세포, 혈청 및 조직합니다. 적절한 경우, 코멘트 및 추가 참조는 수정 여부에 대한 포함되어 있습니다절차 화 : 안정 동위 원소의 포함을 해결하거나, 특히 불안정한 대사 산물 포함 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
타겟이 불분명 한 대사는 내인성 또는 생체이 biotransformations을 조사하거나, 그 샘플의 대사 프로파일을 캡처하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 해상도와 감도, 생성 된 대용량 데이터를 처리 할 수있는 능력을 샘플을 분리하고 분석하는 데 사용되는 기술과 유용한 정보 (예 : 정확한 질량 데이터베이스 검색)에 대한 데이터 집합을 채굴 할 수있는 능력을 가진 기술 저울의 출력. 최근, 이?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 NIH 보조금 P30ES013508 및 5T32GM008076의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 SIEVE 2.0 및 박사 부부에 액세스하기 위해 온도 과학을 감사합니다. 유용한 토론 유진 Ciccimaro 및 온도 과학의 마크 샌더스.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
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