ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス
Summary
非標的メタボロミクスは、代謝プロファイルのスナップショットを生成する仮説を提供します。このプロトコルは、細胞、血清、または組織からの代謝物の抽出と分析を紹介します。代謝物の範囲は、液 – 液相抽出、差分解析ソフトウェアに結合されたマイクロウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー/高分解能質量分析法（UPLC-HRMS）を用いて調査している。
Abstract
ここでは含めて興味のある生物学的サンプルのための代謝プロファイルを分析するためのワークフローを提示し、細胞、血清、または組織。試料を最初に液 – 液相抽出により極性および非極性画分に分離され、部分的に下流の分析を容易にするために精製される。水溶液（極性代謝物）と初期抽出の有機的（非極性代謝物）のフェーズの両方が代謝物の広い範囲を調査するために処理される。代謝産物は、そのパーティション特性に基づいて異なる液体クロマトグラフィー法により分離される。この手法では、マイクロ超性能（UP）LC方法を提示したが、プロトコルがより高い流量と低い圧力に適合している。質量分析計への導入は、一般的な最適化された化合物または元の条件のいずれかを使用してすることができます。イオンの広い範囲の検出は、最近、Cでの高解像度を使用して幅広いのm / z範囲にわたって正と負の両方のモードにおいてフルスキャンモードで行われるalibrated楽器。ラベルフリー差分解析は、バイオインフォマティクスプラットフォーム上で実施される。このアプローチのアプリケーションは、代謝経路のスクリーニング、バイオマーカー探索、及び薬剤開発が含まれています。
Introduction
HRMSの分野における最近の技術の進歩のために、関連性の低い、仮説生成メタボロミクスのアプローチは、複雑なサンプルの分析に実現可能なアプローチになっています。百万ルーチン低い部分を容易にし10万分解能（ppm）の質量精度が可能な1質量分析計が広くなっている複数のベンダーから入手できる。2,3この質量精度は、分析対象のID、同位体パターン認識、および付加物の識別の予備割り当てに大きな特異性と信頼性を可能にします。4適切な抽出法と高性能LCまたはUPLC、複雑な混合物と結合したときリテンションタイムデータから得られ、追加の特異性を分析することができる。5 UPLCが大きくクロマトグラフィー効率を有する、可能なメタボロームの大きいカバレッジを作る高い感度、解像度、分析時間を可能にする。6得られた大量のデータセットを任意に統合することができ多重差解析ソフトウェアおよび7,8,9,10,11推定されるヒットが最初にピーク検出アルゴリズムの組み合わせ、精密質量ベースの化学式予測、フラグメンテーション予測を用いて同定することができる。有用なパターンや目的の分析物について個々の採掘、および化学データベース検索。このアプローチは、定量化のための現在の金の標準的な方法である研究MS /選択/ UPLCまたは多重反応モニタリング時間のかかる完全な構造の識別に以上に敏感とより具体的な安定同位体希釈の開発のためのターゲットの優先順位付けを可能にします。12
生体試料の様々な性質は、尿13、セル14、血清15、または組織16の抽出プロトコルの最適化につながっている。このプロトコルの特徴抽出細胞、血清、組織のために。適切な場合には、コメントや追加の参照はmodificaのために含まれています安定同位体を含めることに対処するための手順のtions、または特に不安定な代謝物の包含のため。
Protocol
1。細胞からのサンプル抽出細胞の10センチ板の場合：事前標識を10mlのガラス遠心管にメディアで持ち上げられた細胞懸濁液1.5mlを集める。接着ラインのために、細胞を氷上で保存メディア1.5mlに優しいスクレイピングと解除されるべきオプション ：社内基準が使用されている場合は、この段階で適切な分量を追加します。 コメント ：細胞代謝のクエンチングは、?…
Representative Results
示された結果は、農薬やミトコンドリア複合体I阻害剤ロテノンとSH-SY5Y神経膠芽腫細胞の6時間の処理から選択したデータを示す。簡潔にするために、唯一の有機相ポジティブモードデータが提示される。サンプルが処理され、上述したように分析した（ 図1、表1、表2）とラベルフリー定量化、およびSIEVE XCMSオンラインで2つの差解析プラットフォーム上にロードした。ヒットの?…
Discussion
非標的メタボロミクスは、内因性または生体異物生物変換を調査したり、興味のあるサンプルからの代謝プロファイルを取得するための強力なツールを提供しています。サンプル、生成された大規模なデータセットに対応する能力、および有用な情報（ 例えば、精密質量データベース検索）のデータセットをマイニングする機能を分離して分析するために使用される技術の分解能と感…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、NIHの助成金P30ES013508と5T32GM008076の支持を認める。またSIEVE 2.0とDRSへのアクセスのためにサーモサイエンティフィックに感謝します。ユージンCiccimaro有用な議論のためのサーモサイエンティフィック社のマーク·サンダース。
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline | Mediatech | 21-031-CM | |
| Water (H2O) | Fisher Scientific | W7-4 | (optima) |
| Acetonitrile (CH3CN) | Fisher Scientific | A996-4 | (optima) |
| Methanol (CH3OH) | Fisher Scientific | A454-4 | (optima) |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | (optima) |
| Chloroform (CH3Cl) | Sigma-Aldrich | 366927 | Hazard |
| Dichloromethane (CH2Cl2) | Acros Organics | 61030-1000 | To replace chloroform |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 346136 | To replace chloroform |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | (optima) | |
| NH4OH | Fisher Scientific | A470-250 | (optima) |
| Ammonium formate (HCOONH4) | Sigma-Aldrich | 78314 | |
| MicroSpin C18 Columns | Nest Group Inc | SS18V | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 ml Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
| 10 ml Plastic Centrifuge Tubes | CellTreat | CLS-4301-015 | |
| LC Vials (glass) | Waters | 60000751CV | |
| LC Inserts (glass) | Waters | WAT094171 | |
| LC Vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
| 0.22 μm Filters | Corning | 8169 | nylon |
| 2 ml Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | Low Retention |
| Equipment | |||
| High Resolution Mass Spectrometer | Thermo Scientific | LTQ XL-Orbitrap | |
| HPLC/UPLC | Waters | nanoACQUITY UPLC | |
| Source | Michrom | Thermo Advance Source | |
| Differential Analysis Software | Thermo Scientific | SIEVE 2.0 | |
| nanoACQUITY C18 BEH130 | Waters | 186003546 | 1.7 μm particle size, 150 mm x 100 μm |
| Acentis Express C8 | Sigma-Aldrich | 54262 | 2.7 μm particle size, 15 cm x 200 μm |
Referências
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Citar este artigo
Snyder, N. W., Khezam, M., Mesaros, C. A., Worth, A., Blair, I. A. Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS). J. Vis. Exp. (75), e50433, doi:10.3791/50433 (2013).