Summary

フローサイトメトリーによるヒト好中球の核因子の活性を検出するために簡単で効率的な方法

Published: April 09, 2013
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Summary

好中球は、血液中に最も豊富に存在する白血球である。好中球は、このような炎症性サイトカインとアポトーシスの抑制​​の生産などの転写調節機能を有する。これらの関数は、単離核で、フローサイトメトリーによって核内因子の検出および定量化を可能にするここに示す方法で研究することができる

Abstract

好中球は、末梢血中に最も豊富に存在する白血球である。これらの細胞は、このように微生物を侵略に対する最初の防衛線となって、炎症や感染部位に最初に表示されています。好中球は、貪食作用、溶菌酵素の放出、活性酸素種の産生などの重要な抗菌機能を有する。これらの重要な防御機能に加えて、好中球などの炎症性サイトカインおよびアポトーシスの阻害の生産などの感染症に対応して他のタスクを実行します。サイトカインは、感染をクリアに役立つ他の白血球をリクルートする、アポトーシスの阻害は、好中球が感染部位で長生きすることができます。これらの機能は、転写レベルで調節されている。好中球は短命の細胞であるため、全く効率が存在しないためしかし、これらの細胞における転写調節応答の研究は、従来のレポーター遺伝子のメソッドで実行することはできません好中球のトランスフェクションのためcientテクニック。ここでは、フローサイトメトリーによって単離し、免疫標識核における核内因子の検出および定量化を可能にするシンプルで効率的な方法を提示する。我々は、ヒト末梢血から純粋な好中球を分離するための手法について説明抗受容体抗体で、これらの細胞を刺激し、隔離し、immunolabel核、フローサイトメトリーで核を分析します。メソッドが成功した好中球および他の細胞型から核内にNF-κBおよびエルク-1核内因子を検出するために使用されています。したがって、この方法では、種々の細胞型から単離核内転写因子の活性を分析するためのオプションを表します。

Introduction

好中球は末梢血1に最も豊富に存在する白血球である。炎症や感染症、好中球の間に、彼らは防衛2の最初の行として働く場所患部に出現する最初の細胞である。好中球は貪食作用、活性酸素種の産生、脱顆粒によって溶菌酵素の放出、および4,5 –炎症性サイトカインの産生を含むいくつかの抗菌メカニズムの3を所有しています 。好中球は急速に様々な細胞表面の受容体からのシグナル伝達を介して活性化取得短命な細胞である。好中球は、その短い寿命のため、端末の細胞と考えられ、炎症過程6の間に活性化されない限り、彼らはアポトーシスを受けるので、それは、彼らはまた、特定の遺伝子の転写のレベルを変更することにより、それらの表現を変更できることが明らかになってきたが。サイトカイン57,8アポトーシスの阻害の生産は、i 2アール好中球の転写レベルで調節mportant活性化に依存した細胞機能。核因子κB(NF-κB)は、サイトカイン産生4の転写制御で、様々な種類の細胞における細胞生存とアポトーシス9-11の調節に関与している。

核因子の活性化につながるシグナル伝達経路は、通常、レポーター遺伝子アッセイにより、または電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって研究されている。好中球は短命の細胞であるため、好中球のトランスフェクションのための効率的な技術が存在しないためしかし、これらの細胞における転写調節応答の研究は、レポーター遺伝子アッセイを使用して実行することはできません。 EMSAのアッセイは、核因子活性化12,13を探索するために好中球に使用されてきたが、それが放射性物質の使用を伴うので、しかしながら、この方法論は、複雑で高価である。クレオはsuccessfu使用されています別の技術であるLLY単球14をトランスフェクトする。したがって、少なくとも理論的には、核因子の活性化は、トランスフェクションによる好中球(低効率にもかかわらず)で検出することができた。しかし、この技術は、時間がかかり、おそらく少ない定量より高価になるだろう。免疫染色された細胞の顕微鏡分析はまた、核内で核内因子を検出するために使用することができる。実際、我々は核 ​​こうして15にNF-κBの転座を検出した。残念なことに、この手法はまた、時間のかかるレス定量的、かつ観察者バイアスの影響を受けます。

ここでは、フローサイトメトリーによって単離し、免疫標識核における核内因子の検出および定量化を可能にするシンプルで効率的な方法を提示する。我々は、F(フローサイトメトリーにより、ヒト末梢血から好中球を分離抗受容体抗体とインテグリンまたはFc受容体を介して、これらの細胞を刺激し、隔離し、immunolabel核を、核を分析するための手法について説明igure 1)。メソッドが成功し、NF-κB15および好中球の核内エルク-1 16核内因子を検出するために使用されています。この方法の感度は、核内の核因子レベルの小さな変化を検出することができます。また、この方法は、他の細胞型から核内転写因子のレベルを分析するために使用することができます。

Protocol

1。ヒトの血液から好中球の分離(PMN) 抗凝固剤としてヘパリン(10 U / ml)で約20mlヒトの血液を使用します。血液はvenopunctureによって成人の健康なボランティアから採取した。 UNAM – 全ての実験は、のInstituto de InvestigacionesBiomédicasにおける生命倫理委員会の承認の下で行われた。 15mlコニカル遠心チューブにPBSで6%デキストランT500の2ミリリットルを入れて、血液の10ミリリッ…

Representative Results

ここに記載の精製方法は、通常は95%( 図1A)を超える純度を有する非刺激好中球(PMN)を提供しています。隔離されたPMNはその後、特定のモノクローナル抗体で架橋する特定の受容体によって刺激することができる。我々は、Fc受容体とインテグリン( 図1B)を介してPMNを刺激してきた。一度刺激、PMNを溶解し、核を高収率で分離されています。核は、そのような?…

Discussion

ここに記載の精製方法は、短時間で95%(顕微鏡観察により評価)、より高い純度を持つ非刺激好中球の分離(PMN)が可能になります。後者は完全に溶解されていない場合、時には好中球は、赤血球によって汚染することができます。赤血球及びPMNを簡単にフローサイトメトリーによって異なる細胞集団として区別することができるので、これは通常、技術に影響を与えません。隔離されたPM…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者は彼女の技術支援のためのナンシーモーラに感謝したいと思います。

この作品は、ConsejoナシオナルデCiencia yをTecnologia、メキシコからの研究助成金48573-Mおよび168098でかつ助成IN212308とIN205311-2 Direccionから一般デAsuntosデルパーソナルAcademico、国立大学自治デ·メキシコ、メキシコによって賄われていた。

Materials

REAGENTS
Heparin PiSA (Mexico)
Dextran T500 Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) T1-Dextran T500
Ficoll-Paque Pharmacia 17-0320-01
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium phosphate monobasic Sigma S9638
Sodium phosphate dibasic Sigma S9390
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153 Cohn Fraction V
HEPES Sigma H3375
Potassium chloride Sigma P9541
Magnesium chloride anhydrous Sigma M8266
DL-dithiothreitol (DTT) Sigma D9163
Trypan Blue (0.4 % solution) Sigma T8154
Paraformaldehyde Sigma P6148
Triton X-100 Sigma X100
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10437-028
Monoclonal antibody IV.3 Medarex (Annandale, NJ) 025-1 Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8 Medarex (Annandale, NJ) 028-2 Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16 Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) Donated by Dr. Martin Hemler Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4 University of California, San Francisco Donated by Dr. Eric J. Brown Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab’)2 goat anti-mouse IgG Cappel (Aurora, OH) 55468
FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG Cappel (Aurora, OH) 55522
FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG Cappel (Aurora, OH) 55665
Anti-NF-κB p50 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) sc-114 Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) sc-109 Rabbit polyclonal antibody
EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube Corning 430791
50-ml centrifuge tube Corning 430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop Dupont Instruments RT 6000D
pH-meter Corning 340
Pipetman pipette P-20 Gilson F123600
Pipetman pipette P-200 Gilson F123601
Pipetman pipette P-1000 Gilson F123602
Hemocytometer Fisher Scientific 0267110
Microscope Nikon Eclipse E600
Inverted microscope Nikon TMS
Water Bath Incubator Fisher Scientific 2IS-M
Microcentrifuge Eppendorf 5414C
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Flow Cytometer Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) FACScalibur

Referências

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Citar este artigo
García-García, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410, doi:10.3791/50410 (2013).

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