Summary

פשוט ויעילה שיטה לגילוי הפעלת פקטור גרעינית בנויטרופילים אדם על ידי זרימת cytometry

Published: April 09, 2013
doi:

Summary

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם. נויטרופילים בעלי פונקציות מוסדרות תעתיק כגון ייצור של ציטוקינים ועיכוב של אפופטוזיס מעודדים דלקת. פונקציות אלה יכולות להיות למדו בשיטה שהוצגה כאן, המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים על ידי cytometry זרימה בגרעינים בודדים

Abstract

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם היקפי. תאים אלה הם ראשונים שמופיעים באתרים של דלקת וזיהום, ובכך להפוך את קו ההגנה הראשון נגד פולשי מיקרואורגניזמים. נויטרופילים בעלי פונקציות מיקרוביאלית חשובות כגון phagocytosis, שחרורו של אנזימי ממוסס, וייצור של מיני חמצן תגובתי. בנוסף לפונקציות בטחוניות החשובות אלה, נויטרופילים לבצע משימות אחרות בתגובה לזיהום, כגון ייצור של ציטוקינים ועיכוב של אפופטוזיס מעודדים דלקת. ציטוקינים לגייס לויקוציטים האחר המסייעים לנקות את הזיהום, ועיכוב של אפופטוזיס מאפשר נויטרופילים לחיות זמן רב יותר באתר של זיהום. פונקציות אלה מוסדרות ברמה של שעתוק. עם זאת, משום שהנויטרופילים הם תאים קצרי חיים, המחקר של תגובות תעתיק מוסדר בתאים אלו לא ניתנים לביצוע בשיטות קונבנציונליות גן כתב מאז אין אפיםטכניקות cient עבור transfection נויטרופילים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים בגרעינים מבודדים וimmunolabeled ידי cytometry זרימה. אנו מתארים טכניקות לבודד נויטרופילים טהורים מדם היקפי אנושי, לעורר תאים אלו עם נוגדנים כנגד הקולטן, לבודד וגרעיני immunolabel, גרעינים ולנתח ידי cytometry זרימה. השיטה כבר משמש בהצלחה לאיתור NF-κB וElk 1-גורמים גרעיניים בגרעינים מנויטרופילים וסוגי תאים אחרים. לכן, שיטה זו מייצגת אפשרות לניתוח הפעלה של גורמי שעתוק בגרעינים בודדים מתוך מגוון של סוגי תאים.

Introduction

הנויטרופילים הם תאי דם הלבנים הנפוצים ביותר בדם היקפי 1. במהלך נויטרופילים דלקת והזיהום הם התאים הראשונים שמופיעים באתר המושפע שם הם משמשים כקו ההגנה הראשון 2. נויטרופילים יש מספר מנגנונים מיקרוביאלית 3 כולל phagocytosis, ייצור של מיני חמצן תגובתי, שחרורו של אנזימי ממוסס ידי degranulation, וייצור של ציטוקינים מעודדים דלקת 4.5. הנויטרופילים הם תאים קצרי חיים שמקבלים מופעלים במהירות דרך איתות מהקולטנים בתא שטח שונים. למרות נויטרופילים כבר נחשבים תאים סופניים עקב חייו הקצרים שלהם ובגלל שהם עוברים אפופטוזיס אלא אם הופעל במהלך התהליך הדלקתי 6, עכשיו זה ברור שהם יכולים גם לשנות פנוטיפ שלהם על ידי שינוי ברמה של שעתוק של גנים מסוימים. הייצור של ציטוקינים 5 והעיכוב של אפופטוזיס 7,8 הם שתיים אניפונקציות תא הפעלה תלויה mportant מוסדרות ברמה של שעתוק בנויטרופילים. הגורם הגרעיני κB (NF-κB) משתתף בשליטת התעתיק של 4 ייצור ציטוקינים וברגולציה של הישרדות תא ואפופטוזיס 9-11 בסוגי תאים שונים.

את מסלולי האיתות שיובילו להפעלת פקטור גרעינית בדרך כלל נחקרו על ידי מבחני גן כתב או על ידי מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA). עם זאת, משום שהנויטרופילים הם תאים קצרי חיים, המחקר של תגובות מוסדרות תעתיק בתאים אלה לא ניתן לבצע עם מבחני גן כתב, שכן יש לא טכניקות יעילות לtransfection נויטרופילים. מבחני EMSA כבר בשימוש בנויטרופילים לחקור הפעלת פקטור גרעינית 12,13, עם זאת, במתודולוגיה זו היא מסובכת ויקרה משום שהיא כרוכה בשימוש בחומר רדיואקטיבי. Nucleofection היא טכניקה נוספת ששמשה successfully לtransfect מונוציטים 14. לפיכך, לפחות בתאוריה, הפעלת פקטור גרעינית יכולה להיות מזוהית בנויטרופילים ידי transfection (למרות יעילות נמוכה). עם זאת, טכניקה זו תהיה יקרה יותר, זמן רב וכנראה פחות כמותית. ניתוח מיקרוסקופי של תאי immunostained גם יכול לשמש כדי לזהות גורמים גרעיניים בגרעין. ואכן, יש לנו זוהיתי טרנסלוקציה NF-κB לתוך הגרעין זו דרך 15. למרבה הצער, טכניקה זו היא גם גוזלת זמן, פחות כמותית, ובכפוף להטיה של הצופה.

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה המאפשרת זיהוי וכימות גורמים גרעיניים בגרעינים מבודדים וimmunolabeled ידי cytometry זרימה. אנו מתארים טכניקות לבודד הנויטרופילים מדם היקפי אנושי, לעורר התאים האלה באמצעות integrins או קולטנים FC עם נוגדנים כנגד הקולטן, לבודד וגרעיני immunolabel, גרעינים ולנתח ידי cytometry זרימה (F1 igure). השיטה כבר משמש בהצלחה לאיתור 15 NF-κB וElk-1 16 גורמים גרעיניים בגרעיני נויטרופילים. הרגישות של שיטה זו מאפשרת זיהוי של שינויים קטנים ברמות פקטור גרעיניים בגרעין. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לנתח את הרמה של גורמי שעתוק בגרעינים מסוגי תאים אחרים.

Protocol

1. בידוד של נויטרופילים (PMN) מדם אדם השתמש כ 20 מיליליטר דם אדם בפרין (10 U / ml) כנוגד קרישה. דם נאסף ממתנדבים בריאים במבוגרי venopuncture. כל הניסויים נעשו במסגרת אישור ועדת ביואתיקה במכון Biomédicas Investigaciones דה – UNAM. <li style=";text-align:right;…

Representative Results

שיטת הטיהור המתוארת כאן בדרך כלל מספק נויטרופילים unstimulated (PMN) עם טוהר יותר מ 95% (איור 1 א). PMN מבודד אז יכול להיות מגורה על ידי קולטנים מסוימים crosslinking עם נוגדנים חד שבטיים ספציפיים. יש לנו מגורה PMN דרך קולטנים וintegrins FC (1B איור). ברגע מגורה, PMN הם lysed וגרעינים…

Discussion

שיטת הטיהור המתוארת כאן מאפשרת בידוד של נויטרופילים unstimulated (PMN) עם טוהר יותר מ 95% (הערכה על ידי תצפית מיקרוסקופית), בזמן קצר. לפעמים הנויטרופילים יכולים להיות מזוהמים על ידי אריתרוציטים אם האחרון לא lysed לחלוטין. זה בדרך כלל אינו משפיע על הטכניקה, שכן בקלות ניתן להבחין אר…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לננסי מורה לקבלת הסיוע הטכני שלה.

עבודה זו מומנה על ידי מענקי מחקר 48573-M ו168098 מConsejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, מקסיקו, ועל ידי מענקי IN212308 וIN205311-2 מDireccion הגנרל דה Asuntos דל האישי Academico, האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו, מקסיקו.

Materials

REAGENTS
Heparin PiSA (Mexico)
Dextran T500 Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) T1-Dextran T500
Ficoll-Paque Pharmacia 17-0320-01
Sodium chloride Sigma S7653
Sodium phosphate monobasic Sigma S9638
Sodium phosphate dibasic Sigma S9390
Bovine serum albumin (BSA) Sigma A2153 Cohn Fraction V
HEPES Sigma H3375
Potassium chloride Sigma P9541
Magnesium chloride anhydrous Sigma M8266
DL-dithiothreitol (DTT) Sigma D9163
Trypan Blue (0.4 % solution) Sigma T8154
Paraformaldehyde Sigma P6148
Triton X-100 Sigma X100
Fetal bovine serum (FBS) GIBCO 10437-028
Monoclonal antibody IV.3 Medarex (Annandale, NJ) 025-1 Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8 Medarex (Annandale, NJ) 028-2 Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16 Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) Donated by Dr. Martin Hemler Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4 University of California, San Francisco Donated by Dr. Eric J. Brown Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab’)2 goat anti-mouse IgG Cappel (Aurora, OH) 55468
FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-mouse IgG Cappel (Aurora, OH) 55522
FITC-conjugated F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG Cappel (Aurora, OH) 55665
Anti-NF-κB p50 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) sc-114 Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) sc-109 Rabbit polyclonal antibody
EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube Corning 430791
50-ml centrifuge tube Corning 430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop Dupont Instruments RT 6000D
pH-meter Corning 340
Pipetman pipette P-20 Gilson F123600
Pipetman pipette P-200 Gilson F123601
Pipetman pipette P-1000 Gilson F123602
Hemocytometer Fisher Scientific 0267110
Microscope Nikon Eclipse E600
Inverted microscope Nikon TMS
Water Bath Incubator Fisher Scientific 2IS-M
Microcentrifuge Eppendorf 5414C
Microcentrifuge Eppendorf 5418
Flow Cytometer Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) FACScalibur

Referências

  1. Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
  2. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  3. Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
  4. Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
  5. Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
  6. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
  7. Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W. Molecular control of neutrophil apoptosis. FEBS Lett. 487, 318-322 (2001).
  8. Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
  9. Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
  10. Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
  11. Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
  12. Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
  13. Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
  14. Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
  15. Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
  16. Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).

Play Video

Citar este artigo
García-García, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410, doi:10.3791/50410 (2013).

View Video