Fastsettelse av Microbial Ekstracellulær enzymaktivitet i Waters, jord og sedimenter ved hjelp av høy gjennomstrømming for mikro Analyser

Mikroorganismer som bakterier og sopp skaffe næringsstoffer og karbon fra komplekse organiske forbindelser gjennom produksjon av ekstracellulære enzymer. Disse enzymene vanligvis hydrolyze polymerer i mindre subenheter som kan tas opp i cellene. Derfor, i et økologisk nivå, disse ekstracellulære mikrobielle enzymer er ansvarlige for mye av næringsstoff mineralisering og organisk materiale nedbrytning som forekommer i naturlige omgivelser. Enzymer slik som cellobiohydrolase (CBH) og β-glukosidase er viktige for cellulosedegradering og arbeider unisont for å katalysere hydrolysen av cellulose til glukose ^1,2, noe som gir en utilizable karbon substrat for mikrobiell opptak og assimilasjon. Enzymet fosfatase utgivelser løselige uorganiske fosfatgrupper fra organofosfater, i hovedsak mineralizing fosfat og gjør den tilgjengelig for bruk av de fleste organismer ^3. Andre enzymer, slik som N-acetylglucosaminidase (Nagase), er important i kitin degradering og kan gjøre både karbon og nitrogen tilgjengelig for mikrobiell oppkjøpet ^fire.

En av de fremgangsmåter for analyse av mikrobiell ekstracellulær enzymaktivitet i naturlige omgivelser er bruken av kunstig p-nitrofenyl-(p NP) koblede substrater, en fremgangsmåte som opprinnelig ble utviklet for å detektere jord fosfataseaktivitet ^5. Denne fremgangsmåten er avhengig av detektering av et farget sluttprodukt, p-nitrofenol, som frigjøres når det kunstige substrat blir hydrolysert av det aktuelle enzym. Den p-nitrofenol kan deretter bli kvantifisert kolorimetrisk ved å måle absorbans ved ca 400 til 410 nm. Metoden har senere blitt anvendt for å påvise andre enzymer så som Nagase ^6, og har vært brukt i forskjellige studier ser på mikrobiell ekstracellulær enzymaktivitet i jord og sedimenter ^7-9.

En alternativ tilnærming som var originally utviklet for å vurdere ekstracellulære glukosidase aktivitet i akvatiske miljøer ^10,11 gjør bruk av fire-methylufilbelli (MUB) knyttet underlag. Sluttproduktet sluppet (4-methylufilbelli) er svært fluoriserende og kan påvises ved hjelp av en fluorometer med en eksitasjon / emisjon omgivelser rundt 360/460 nm. En rekke MUB-koblede kunstige substrater er tilgjengelige, tillater fluorometrisk måling av aktiviteten av minst like mange enzymer (f.eks β-glucosidase, cellobiohydrolase, Nagase, fosfatase) som kan undersøkes ved hjelp av p NP-substrat kolorimetriske prosedyre. Andre mikrobielle ekstracellulære enzymer slik som protein-nedbrytende leucin aminopeptidase, kan analyseres ved hjelp av fluorometrisk 7-amino-4-methylcoumarin (COU) koblede substrater. Både MUB-og COU-koblede substrater har blitt brukt til å bestemme enzymaktivitet i ulike terrestriske og akvatiske prøver ^12,13.

Mens tidligere studier har descrIbed fluorometrisk eller kolorimetrisk mikro tilnærminger for å bestemme ekstracellulær enzymaktivitet ^14, er det behov for en klar presentasjon av hvordan å gjennomføre slike analyser. Her har vi også vist fremgangsmåter for å drive høye gjennomløpsmikro teknikker for analyse av ekstracellulær enzymaktivitet i jord og sedimenter ved hjelp av kolorimetrisk p-NP-bundet substrater tilnærming og i naturlig vann ved bruk av det fluorescerende MUB-koblede substrater teknikk. Vi fokuserer på måling av virksomheten til β-glukosidase, Nagase, og fosfatase som disse enzymene kan knyttes til karbon, nitrogen og fosfor sykling, henholdsvis. Imidlertid kan fremgangsmåten som er beskrevet her kan brukes til måling av andre ekstracellulære enzymer med forskjellige kunstige substrater.