Summary

קביעת מיקרוביאלית התאית אנזים הפעילות במים, קרקעות, ומשקעים באמצעות מבחני Microplate תפוקה גבוהה

Published: October 01, 2013
doi:

Summary

נהלי Microplate מבוססות מתוארים לניתוח colorimetric או fluorometric של פעילות אנזים תאית. נהלים אלה מאפשרים לassay המהיר של פעילות מסוג זה במספר הגדול של דגימות סביבתיות בתוך מסגרת זמן לניהול.

Abstract

חלק גדול מהרכיבה על האופניים מזינים ועיבוד פחמן בסביבה טבעית מתרחש באמצעות הפעילות של אנזימים תאיים שפורסמו על ידי מיקרואורגניזמים. לכן, מדידה של הפעילות של אנזימים תאיים אלה יכול לתת תובנות השיעורים של תהליכים ברמת מערכת אקולוגית, כגון פירוק חומר אורגני או חנקן וזרחן מינרליזציה. מבחני של פעילות אנזים תאית בדגימות סביבתיות בדרך כלל כרוכים חושפים את הדגימות למצעי colorimetric או fluorometric מלאכותיים ומעקב אחר השיעור של הידרוליזה מצע. כאן אנו מתארים שיטות microplate המבוסס על נהלים אלה המאפשרים הניתוח של מספר הגדול של דגימות תוך פרק זמן קצר. דוגמאות מותרת להגיב במצעים מלאכותיים תוך 96 גם microplates או גם עמוקים בלוקים microplate, ופעילות אנזים נקבעה לאחר מכן על ידי קליטה הקרינה או של המוצר הסופי וכתוצאה מכך באמצעות ריד microplate טיפוסיr או fluorometer. נהלי תפוקה גבוהה כגון להקל לא רק השוואות בין אתרים או מערכות אקולוגיות במרחב נפרדים, אלא גם להפחית באופן משמעותי את העלות של מבחני אלה על ידי צמצום כמויות מגיב הכוללות הנדרשות לדגימה.

Introduction

מיקרואורגניזמים כגון חיידקים ופטריות להשיג חומרים מזינים ופחמן מתרכובות אורגניות מורכבות באמצעות הייצור של אנזימים תאיים. אנזימים אלה בדרך כלל hydrolyze פולימרים ליחידות משנה קטנה יותר שאפשר לקחת אל תוך התא. לכן, ברמה אקולוגית, אנזימים תאיים של חיידקים אלו אחראים לחלק גדול ממינרליזציה התזונתית ופירוק חומר אורגני המתרחש בסביבות טבעיות. אנזימים כגון cellobiohydrolase (CBH) וβ-glucosidase חשובים לפירוק תאית ועבודה ביחד כדי לזרז הידרוליזה של תאית לגלוקוז 1,2, המספקת מצע פחמן לניצול לספיגה והטמעה של חיידקים. Phosphatase האנזים משחרר מסיסי קבוצות אורגניות פוספט מזרחנים אורגניים, במהות mineralizing פוספט והופך אותו זמין לשימוש על ידי רוב האורגניזמים 3. אנזימים אחרים, כגון N-acetylglucosaminidase (Nagase), הם importanלא בשפלת כיטין והוא יכול לעשות את שני פחמן וחנקן זמין לרכישת חיידקים 4.

אחד מההליכים עבור assay של פעילות אנזים תאית של חיידקים בסביבות טבעיות הוא השימוש בp-nitrophenyl המלאכותי מצעים (NP עמ ') מקושרים, גישה שפותחה במקור כדי לזהות פעילות phosphatase אדמת 5. גישה זו מסתמכת על זיהוי של מוצר בצבע תום, p-nitrophenol, המשתחרר כאשר המצע מלאכותי הידרוליזה על ידי האנזים המתאים. P-nitrophenol ניתן לכמת בהמשך colorimetrically ידי מדידת הספיגה שלה בסביבות 400-410 ננומטר. שיטה זו מאז הוחל לזהות אנזימים אחרים כגון Nagase 6, וכבר נעשה שימוש במחקרים שונים מסתכלת על פעילות אנזים תאית של חיידקים בקרקעות ומשקעים 7-9.

גישה חלופית שהייתה originally פותח כדי להעריך את פעילות glucosidase תאית בסביבות מימית 10,11 עושה שימוש 4 methylumbelliferone-(MUB) מצעים מקושרים. המוצר הסופי שפורסם (4-methylumbelliferone) הוא ניאון מאוד וניתן לאתר באמצעות fluorometer עם הגדרת עירור / פליטה סביב 360/460 ננומטר. מגוון מצעים מלאכותיים MUB צמודים זמין, המאפשר מדידת fluorometric של הפעילות של אנזימים לפחות כמו רבים (למשל β-glucosidase, cellobiohydrolase, Nagase, phosphatase) כפי שניתן assayed באמצעות הליך colorimetric NP-מצע p. אנזימים אחרים חיידקים תאיים, כגון aminopeptidase לאוצין החלבון משפיל, יכולים להיות assayed fluorometrically באמצעות 7-אמינו-4-methylcoumarin (COU) מצעים מקושרים. שני MUB ומצעי COU צמודים היו בשימוש כדי לקבוע פעילות אנזים בדגימות יבשתית ומימיות שונות 12,13.

בעוד שהמחקרים קודמים descrmicroplate fluorometric או colorimetric ibed גישות כדי לקבוע פעילות אנזים תאית 14, יש צורך בהצגה ברורה של איך לנהל מבחני כאלה. כאן אנו מדגימים נהלים לביצוע טכניקות microplate תפוקה גבוהות לניתוח פעילות אנזים תאי בקרקעות ומשקעים בגישת מצעים צמודים NP p colorimetric ובמים הטבעיים באמצעות טכניקת מצעי MUB צמודת הניאון. אנו מתמקדים במדידה של הפעילות של β-glucosidase, Nagase, וphosphatase כיכולים להיות קשורים אנזימים אלה לפחמן, חנקן, זרחן ורכיבה על אופניים, בהתאמה. עם זאת, ניתן ליישם הנהלים שתוארו כאן כדי המדידה של אנזימים תאיים אחרים באמצעות מצעים מלאכותיים שונים.

Protocol

ניתוח Colorimetric של תאית אנזים פעילות בקרקעות ומשקעים 1. הכנת התשתית ופתרונות הצפת לניתוח Colorimetric של אנזים פעילות H להכין 50 מ"מ אצטט חיץ (pH 5.0-5.5) על ידי ערבוב חומצת 50 מיליליטר 0.1 M אצטית (2….

Representative Results

קרקעות ומשקעים ימיים יש בדרך כלל רמות ניכרות של פעילות אנזים תאית כתוצאה מקהילות המצורפות חיידקים (biofilms) גובר על פני השטח של חלקיקים. איור 3 מראה כיצד פעילות זו משתנה בהתאם לגודל של חלקיקים המתקבלים מהמשקעים של כשליש המשטח זרם כדי שבצפון מיסיסיפי, ארה"ב. מח…

Discussion

קביעת הפעילות של מגוון רחב של אנזימים תאיים של חיידקים בקרקעות ומשקעים יכולות לספק תובנות שימושיות לשיעורים של מינרליזציה התזונתית ועיבוד חומר אורגני 17. עם זאת, קרקעות יכולות להשתנות ברמות הלחות שלהם, ולכן חשוב לבצע סטנדרטיזציה של פעילות למשקל יבש אדמה. זה דור…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מימון להיבטים של עבודה זו סופק על ידי מקורות שונים, כולל ארצות הברית מחלקת חקלאות ההסכם שיתופי ספציפי 58-6408-1-595 והקרן הלאומית למדע (הפרס 1,049,911).

Materials

REAGENTS AND MATERIALS
Glacial acetic acid Various suppliers
Sodium acetate Various suppliers
Sodium hydroxide Various suppliers
p-Nitrophenol Fisher BP612-1 Alternates available
p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate Sigma N3234 pNP-substrate
pNP-β-glucopyranoside Sigma N7006 pNP-substrate
pNP-β-N-acetylglucosaminide Sigma N9376 pNP-substrate
Clear 96-well microplates Fisher 12-563-301 Alternates available
96-well deep well blocks Costar 3958 Alternates available
Aluminum weigh pans Various suppliers
Sterile 15 ml centrifuge tubes Various suppliers
Sterile 50 ml centrifuge tubes Various suppliers
4-Methylumbelliferone Sigma M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate Sigma M8883 MUB-substrate
4-MUB-glucopyranoside Sigma M3633 MUB-substrate
4-MUB-N-acetylglucosaminide Sigma M2133 MUB-substrate
Sodium bicarbonate Various suppliers
Black 96-well microplate Costar 3792
Pipette reservoir Various suppliers
EQUIPMENT
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge rotor Eppendorf A-4-81 For microplates/deep-well blocks
Microplate reader BioTek Synergy HT Alternates available
Microplate fluorometer BioTek FLx 800 Alternates available
8-channel pipettor Various suppliers

Referências

  1. Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -. E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
  2. Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
  3. Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
  4. Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
  5. Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
  6. Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
  7. Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
  8. Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
  9. Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
  10. Hoppe, H. -. G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
  11. Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
  12. Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
  13. Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
  14. Marx, M. -. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
  15. Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
  16. Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
  17. Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
  18. Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
  19. Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
  20. Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
  21. Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
  22. Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).

Play Video

Citar este artigo
Jackson, C. R., Tyler, H. L., Millar, J. J. Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays. J. Vis. Exp. (80), e50399, doi:10.3791/50399 (2013).

View Video