Summary

Mitochondrien-assoziierte ER Membranen (MAMs) und Glycosphingolipid Angereichert Mikrodomänen (GEM): Isolation aus Mäusehirn

Published: March 04, 2013
doi:

Summary

Dieser Vorgang zeigt, wie aus dem erwachsenen Gehirn der Maus die Mitochondrien-assoziierte ER Membranen oder MAMs und den Glykosphingolipid angereicherten Mikrodomänen Fraktionen aus MAMs und mitochondrialen Vorbereitungen zu isolieren.

Abstract

Intrazellulären Organellen sind hochdynamische Strukturen mit unterschiedlicher Form und Zusammensetzung, die Zell-spezifischen intrinsischen und extrinsischen Hinweise ausgesetzt sind. Ihre Membranen werden häufig an definierten Kontaktstellen, die Naben für den Austausch von Signalmolekülen und Membrankomponenten 1,2,3,4 geworden gegenübergestellt. Die miteinander organellären Membranmikrodomänen, die zwischen dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und den Mitochondrien bei der Öffnung des IP3-Ca 2 +-Kanal als den Mitochondrien-ER zugehörigen Membranen oder MAMs 4,5,6 bekannt sind ausgebildet sind. Das Protein / Lipid-Zusammensetzung und biochemischen Eigenschaften dieser Membran Kontaktstellen wurden ausgiebig insbesondere in Bezug auf ihre Rolle bei der Regulierung der intrazellulären Ca 2 + 4,5,6 untersucht. Die ER dient als primären Speicher von intrazellulärem Ca 2 +, und reguliert in diesem Rahmen eine Vielzahl von zellulären Prozessen stromabwärts von Ca 2 +-Signalisierung, inkl.uding posttranslationale Proteinfaltung und Protein maturation7. Mitochondrien, auf der anderen Seite aufrechtzuerhalten Ca 2 +-Homöostase durch Puffern zytosolischen Ca 2 +-Konzentration wodurch die Einleitung Apoptosewege stromabwärts von Ca 2 + 4,8 Unwucht. Der dynamische Charakter der MAMs macht sie zu idealen Standorte, um grundlegende zelluläre Mechanismen, einschließlich Ca 2 +-Signalisierung und Regulation der mitochondrialen Ca 2 +-Konzentration, Lipid-Biosynthese und Transport, Energiestoffwechsel und das Überleben der Zelle 4,9,10,11,12 sezieren. Mehrere Protokolle wurden für die Reinigung dieser Mikrodomänen aus Lebergewebe und kultivierten Zellen 13,14 beschrieben.

Unter zuvor publizierten Methoden in Betracht, haben wir ein Protokoll für die Isolierung von Mitochondrien und MAMs vom erwachsenen Mäusehirn angepasst. Um dieses Verfahren haben wir eine zusätzliche Reinigungsstufe, nämlich ein Triton X100 Extraktion hinzugefügt, die enables die Isolierung des Glycosphingolipid angereicherten Mikrodomäne (GEM) Bruchteil der MAMs. Diese Zubereitungen GEM teilen sich mehrere Proteinkomponenten mit Caveolae und Lipidflößen, aus der Plasmamembran oder anderen intrazellulären Membranen abgeleitet und vorgeschlagen, als Sammelpunkte für die Bündelung von Rezeptorproteinen und für Protein-Protein-Wechselwirkungen 4,15 funktionieren.

Protocol

Das folgende Protokoll ist für die Isolierung und Aufreinigung von MAMs und Edelsteine ​​aus Maushirn bestimmt Lösungen für die Isolierung von Mitochondrien, MAMs und Edelsteine ​​benötigt Fraktionierung, um rohes mitochondrialen Präparation zu erhalten: Lösung A: 0,32 M Saccharose, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM CaCl 2 + Protease-Inhibitoren (add frisch, je nach Be…

Representative Results

Basierend auf unserer Erfahrung mit der Verwendung dieses Protokoll können wir sicher empfehlen es für die Isolierung und Reinigung von MAMs, Edelsteine ​​und mitochondriale Fraktionen aus Mäusehirn. Das Verfahren wie oben in hohem Maße reproduzierbar und konsistent. In Abbildung 1 zeigen wir ein repräsentatives Bild des Weges pure Mitochondrien und MAMs Schicht auf einem Percoll-Gradienten (Schritt 3,4). Eine definierte, milchige Band enthaltenden gereinigten Mitochondrien (Mito-P) segregiert …

Discussion

Die Stellen des Kontakts zwischen intrazellulären Membranen oder zwischen Organellen und der Plasmamembran von Zellen repräsentieren dynamischen Signalisierung Plattformen für grundlegende zelluläre Prozesse. Die genaue Charakterisierung ihrer Funktion und Zusammensetzung sowohl unter physiologischen und pathologischen Bedingungen erfordert zuverlässige und reproduzierbare Reinigung Protokolle. Die Verfahren detailliert hier wurden speziell von unserem Labor zur Isolierung und Aufreinigung der MAMs und ihre entspre…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir erkennen den Beitrag von Renata Sano in der Konzeption des ersten Protokolls. Ad'A. hält die Jewelers Für Kinder (JFC) Stiftungsprofessur für Genetik und Gentherapie. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH Zuschüsse GM60905, DK52025 und CA021764, und den amerikanischen libanesischen syrischen Assoziierte Charities (ALSAC) finanziert.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
REAGENTS
Fractionation
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761
Magnesium Chloride, Hexahydrate Fisher Scientific BP214-500
Calcium Chloride, Dihydrate Sigma-Aldrich C-5080
MAM
D-Mannitol Sigma-Aldrich M9546-250G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
EGTA Sigma-Aldrich E4378-250G
BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate Roche 03-116-964-001
Percoll GE 17-0891-02
GEM
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500 ml
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Tris Base Roche 03-118-142-001
HCl Fisher Scientific A144S-500
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Common
Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free Roche 11-873-580-001
EQUIPMENT
2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders Kimble Chase 885300-0002
15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon BD 352097
30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-30
15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-15
Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm Beckman-Coulter 344059
Parafilm Cole-Parmer PM996
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ Fisher Scientific 13-678-20C

Referências

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Annunziata, I., Patterson, A., d’Azzo, A. Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain. J. Vis. Exp. (73), e50215, doi:10.3791/50215 (2013).

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