Summary

Mitochondriën-geassocieerde ER Membranen (eigen MTM) en glycosfingolipiden Verrijkt microdomeinen (GEM): Isolatie van Mouse Brain

Published: March 04, 2013
doi:

Summary

Deze procedure laat zien hoe u te isoleren van de volwassen hersenen van muizen de mitochondriën-geassocieerde ER membranen of Mams en de glycosfingolipiden verrijkte microdomain fracties uit Mams en mitochondriale preparaten.

Abstract

Intracellulaire organellen zijn zeer dynamische structuren met verschillende vorm en samenstelling, die onderworpen zijn aan celspecifieke intrinsieke en extrinsieke signalen. De membranen zijn vaak naast elkaar op gedefinieerde contact sites die worden hubs voor de uitwisseling van signaalmoleculen en membranen 1,2,3,4. De inter-organellen membraan microdomeinen die gevormd tussen het endoplasmatisch reticulum (ER) en de mitochondriën in de opening van de IP3-gevoelige Ca 2 + kanaal staan ​​bekend als de mitochondria bijbehorende ER-membranen of 4,5,6 eigen MTM. Het eiwit / lipiden en biochemische eigenschappen van deze membraan contactplaatsen zijn uitgebreid bestudeerd met name wat betreft hun rol bij het ​​reguleren van intracellulaire Ca2 + 4,5,6. De ER dient als de primaire opslag van intracellulaire Ca 2 +, en in die hoedanigheid regelt een groot aantal cellulaire processen stroomafwaarts van Ca 2 + signalering, inclUding post-translationele vouwing van eiwitten en eiwit maturation7. Mitochondria, anderzijds, behouden Ca2 + homeostase, door buffering cytosolische Ca2 + concentratie waardoor ze de inleiding van apoptotische routes stroomafwaarts van Ca 2 + 4,8 onbalans. Het dynamische karakter van de eigen MTM maakt ze ideaal sites te ontleden elementaire cellulaire mechanismen, met inbegrip van Ca 2 + signalisatie en regulatie van mitochondriale Ca 2 + concentratie, lipide biosynthese en het transport-, energie-metabolisme en celoverleving 4,9,10,11,12. Verschillende protocollen zijn beschreven voor de zuivering van deze microdomeinen van leverweefsel en gekweekte cellen 13,14.

Eerder gepubliceerde werkwijzen waarbij rekening hebben we een aangepast protocol voor de isolatie van mitochondria en eigen MTM van de volwassen muizenhersenen. Deze procedure hebben we een extra zuiveringsstap, namelijk een Triton X100 extractie, dat enables het isolement van de glycosfingolipiden verrijkte microdomain (GEM) fractie van de eigen MTM. Deze preparaten GEM delen verschillende eiwitcomponenten met caveolae en lipide rafts, afkomstig van het plasmamembraan of andere intracellulaire membranen en voorgesteld om als verzamelen punten voor de clustering van receptor eiwitten en eiwit-eiwit interacties 4,15.

Protocol

Het volgende protocol is bedoeld voor de isolatie en zuivering van Mams en parels van muizenhersenen Oplossingen die nodig zijn voor Isolatie van mitochondriën, Mams en GEM Fractionering van ruwe mitochondriale preparaat te verkrijgen: Oplossing A: 0,32 M sucrose, 1 mM NaHCO 3, 1 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl2 + proteaseremmers (vers toevoegen indien nodig) <st…

Representative Results

Op basis van onze ervaring met het gebruik van dit protocol kunnen we veilig het aanraden voor de isolatie en zuivering van Mams, edelstenen en mitochondriale fracties van hersenen van muizen. De procedure als aangegeven is zeer reproduceerbaar en consistent. In figuur 1 tonen we een representatief beeld van de manier waarop pure mitochondria en eigen MTM laag op een Percoll gradiënt (stap 3.4). Een gedefinieerde, melkachtig band die gezuiverde mitochondria (Mito-P) scheidt onderaan de ultracentrifuge …

Discussion

De sites van contact tussen intracellulaire membranen of tussen organellen en het plasmamembraan van cellen vertegenwoordigen dynamische signalering platforms voor basale cellulaire processen. De nauwkeurige karakterisering van hun functie en de samenstelling zowel onder fysiologische en pathologische condities vereist betrouwbare en reproduceerbare zuivering protocollen. De hier beschreven methoden zijn specifiek geoptimaliseerd door ons laboratorium voor de isolatie en zuivering van de Mams en hun overeenkomstige pare…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij erkennen de bijdrage van Renata Sano in het concipiëren van het eerste protocol. Ad'A. houdt de Juweliers For Children (JFC) leerstoel in de genetica en gentherapie. Dit werk werd deels gefinancierd door NIH subsidie ​​GM60905, DK52025 en CA021764, en de Amerikaanse Libanese Syrische Associated Charities (ALSAC).

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
REAGENTS
Fractionation
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761
Magnesium Chloride, Hexahydrate Fisher Scientific BP214-500
Calcium Chloride, Dihydrate Sigma-Aldrich C-5080
MAM
D-Mannitol Sigma-Aldrich M9546-250G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
EGTA Sigma-Aldrich E4378-250G
BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate Roche 03-116-964-001
Percoll GE 17-0891-02
GEM
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-500 ml
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Tris Base Roche 03-118-142-001
HCl Fisher Scientific A144S-500
EDTA Fisher Scientific BP120-500
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-500
Common
Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free Roche 11-873-580-001
EQUIPMENT
2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders Kimble Chase 885300-0002
15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon BD 352097
30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-30
15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes Kimble Chase 45500-15
Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm Beckman-Coulter 344059
Parafilm Cole-Parmer PM996
Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ Fisher Scientific 13-678-20C

Referências

  1. Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one. Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).
  2. Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE. J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).
  3. Levine, T., Rabouille, C. Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues. Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).
  4. Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d’Azzo, A. GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).
  5. Raturi, A., Simmen, T. Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM). Biochim. Biophys. Acta. , (2012).
  6. Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum. Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).
  7. d’Azzo, A., Tessitore, R. Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response. Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).
  8. Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).
  9. Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science. 262, 744-747 (1993).
  10. Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane. EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).
  11. Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).
  12. Grimm, S. The ER-mitochondria interface: the social network of cell death. Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).
  13. Vance, J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria. J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).
  14. Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells. Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).
  15. Pizzo, P., Viola, A. Lymphocyte lipid rafts: structure and function. Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).

Play Video

Citar este artigo
Annunziata, I., Patterson, A., d’Azzo, A. Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain. J. Vis. Exp. (73), e50215, doi:10.3791/50215 (2013).

View Video