Visualização das respostas toxina bacteriana induzida por microscopia de fluorescência de células vivas

Toxinas bacterianas ligar ao colesterol em membranas, formando poros que permitem o vazamento do conteúdo celular e influxo de materiais a partir do ambiente externo. A célula pode recuperar-se este insulto, o que requer processos de reparação activos de membrana, ou morrem, dependendo da quantidade de exposição a uma toxina e tipo de célula ^1. Além disso, estas toxinas induzir fortes respostas inflamatórias em hospedeiros infectados através da activação de células imunitárias, incluindo macrófagos, que produzem uma variedade de citocinas pró-inflamatórias ^2. Muitas bactérias Gram-positivas produzem toxinas colesterol vinculativos que foram mostrados para contribuir para a sua virulência através de mecanismos largamente descaracterizados.

Alterações morfológicas na membrana plasmática das células expostas a estas toxinas incluem a sua sequestração em saliências colesterol enriquecidas de superfície, que podem ser derramadas para o espaço extracelular, sugerindo uma defesa celular intrínsecomecanismo de ^3,4. Este processo ocorre em todas as células na ausência de actividade metabólica, e pode ser visualizada usando EM após ⁴ a fixação química. Em células do sistema imunológico, tais como os macrófagos, que medeiam a inflamação em resposta a exposição a uma toxina, vesículas de membrana induzidas são sugeridos para conter citocinas da família IL-1, e pode ser responsável tanto para o derramamento de toxinas e disseminação destas citoquinas pró-inflamatórias ^5,6,7. A ligação entre a IL-1β libertação e um tipo específico de morte celular, denominado pyroptosis tem sido sugerido, como ambos os processos são dependentes da caspase-1 ^8. Para resolver as complexidades desta resposta de macrófagos, que inclui a ligação da toxina, o derramamento de vesículas de membrana, a libertação de citoquinas, e da morte de células potencialmente, desenvolvemos técnicas de etiquetagem e de métodos de microscopia de fluorescência que permitem a visualização em tempo real da toxina de células-interacções, incluindo medidas de disfunção e morte (Figura 1). Usarde imagens de células vivas é necessária devido às limitações das outras técnicas. Abordagens bioquímicas não pode resolver os efeitos que ocorrem em células individuais, ao passo que a citometria de fluxo não oferece alta resolução, a visualização em tempo real das células individuais. Os métodos descritos aqui podem ser aplicados a análise cinética de respostas induzidas por estímulos que envolvem complexos alterações fenotípicas em células.