ויזואליזציה של תגובות מושרות רעלן של חיידקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא החי
Summary
שיטות לטיהור הכולסטרול המחייב הרעל streptolysin O מרקומביננטי<em> א coli</em> ויזואליזציה של הרעלן מחייב לחיות תאים האיקריוטים מתוארות. אספקה מקומית של הרעלן גורמת לשינויים מהירים ומורכבים בתאים ממוקדים חושפים היבטים חדשניים של ביולוגית רעל.
Abstract
רעלנים חיידקיים נקשרים לכולסטרול בממברנות, ויצרו נקבוביים המאפשרים זליגה של תכנים וזרם של חומרים מהסביבה החיצונית סלולריים. התא יכול להתאושש מהעלבון הזה, שדורש תהליכי תיקון קרום פעילים, אחרת ימות תלוי בכמות חשיפת רעל וסוג תא 1. בנוסף, רעלים אלו לגרום לתגובות דלקתיות חזקות במארחים נגועים באמצעות הפעלה של תאים חיסוניים, כוללים מקרופאגים, אשר מייצרים מערך של ציטוקינים פרו דלקתיים 2. חיידקים חיוביים גרמו רבים לייצר רעלים מחייבים כולסטרול אשר הוכח לתרום לארסיותם באמצעות מנגנוני uncharacterized במידה רבה.
שינויים המורפולוגיים בקרום הפלזמה של תאים שנחשפו לרעלים אלו כוללים קיבוע שלהם לתוך בליטות על פני שטח כולסטרול מועשרים, שניתן לשפוך לתוך חלל החוץ התאי, דבר המצביע הגנה סלולרית פנימיתמנגנון 3,4. תהליך זה מתרחש בכל התאים בהיעדר הפעילות המטבולית, ויכול להיות חזותי באמצעות EM לאחר 4 קיבעון כימי. בתאי מערכת חיסון כגון מקרופאגים אשר מתווכים דלקת בתגובה לחשיפת רעל, שלפוחית קרום מושרה הם הציעו מכילות ציטוקינים של משפחת IL-1 ויכולה להיות אחראי לשפיכה הוא רעל והפצת ציטוקינים אלו פרו דלקתי 5,6,7. קשר בין השחרור IL-1β וסוג מסוים של מות תאים, pyroptosis כינה הוצע, כמו גם תהליכים caspase-1 תלוי 8. כדי למיין את המורכבות של התגובה הזאת macrophage, הכוללת קשירת רעל, שפיכת השלפוחית בממברנה, שחרור ציטוקין, ומוות פוטנציאלי תא, פתחו טכניקות ושיטות תיוג מיקרוסקופ פלואורסצנטי המאפשרות הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות רעל תאים, כולל מדידות של תפקוד ומוות (איור 1). להשתמששל הדמית תא חייה הוא הכרחי בשל מגבלות בטכניקות אחרות. גישות ביוכימיות לא יכולות לפתור את תופעות המתרחשות בתאים בודדים, ואילו זרימה cytometry אינו מציע רזולוציה גבוהה הדמיה, בזמן אמת של תאים בודדים. השיטות שתוארו כאן יכולות להיות מיושמת על ניתוח הקינטית של תגובות הנגרמות על ידי גירויים אחרים הקשורות בשינויים פנוטיפי מורכבים בתאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקות מתוארות כאן מאפשרים בחינת תגובותיהם של תאי מערכת חיסון לרעלים חיידקיים. השלב הקריטי ביותר הוא הטיפול ומינון של הרעל. פעילות רעלן יכולה להיות שונה מאוד, אפילו בין aliquots השונה של אותו התכשיר, עקב שבירותה. זה מחייב גם בדיקה של כל aliquot של רעל נגד קו או RBCs תא הפניה א?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לריצ'רד מנוחה על המתנה הנדיבה של anthrolysin O, מיכאל Caparon על המתנה הנדיבה של פרנקי פלסמיד וג'ונתן slo לסיוע טכני. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקי T32CA82084 (פאק), וR01AI072083 (RDS).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) | ||||||||||||||||||
| Ni-NTA agarose | Qiagen | 30210 | |||||||||||||||||||
| polymixin-agarose | Sigma | P1411-5ML | |||||||||||||||||||
| Zeba Desalt Spin col | Fisher | PI-89891 | |||||||||||||||||||
| sheep RBCs | Fisher | 50-415-688 | |||||||||||||||||||
| pBADgIII-SLO | N/A | N/A | see ref9 | ||||||||||||||||||
| Cy5 monoreactive dye | GE Healthcare | PA25001 | |||||||||||||||||||
| Fura2-AM | Life Technologies | F1221 | |||||||||||||||||||
| Calcein AM/ Ethidium homodimer | Life Technologies | L3224 | |||||||||||||||||||
| Anti-CD11c-APC | BD Biosciences | 550261 | |||||||||||||||||||
| collagen-coated glass-bottom dish | Mattek | P35GCol-1.5-10-C | |||||||||||||||||||
| femto-tip II | Fisher | E5242957000 | |||||||||||||||||||
| Microloader | Fisher | E5242956003 | |||||||||||||||||||
| dextran Alexa 555 | Life Technologies | D34679 | |||||||||||||||||||
| Injectman NI 2 | Eppendorf | 920000029 | |||||||||||||||||||
| FemtoJet | Eppendorf | 5247 000.013 | |||||||||||||||||||
Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed. |
|||||||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||||||
Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed. |
Referências
- Walev, I. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).
- Walev, I. Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2. J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).
- Scolding, N. J. Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement. Nature. 339, 620-622 (1989).
- Keyel, P. A. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).
- MacKenzie, A. Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding. Immunity. 15, 825-835 (2001).
- Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages. J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).
- Andrei, C. Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).
- Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis. Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).
- Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O. EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).
- Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity. Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).
- Watkins, S. C., Salter, R. D. Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules. Immunity. 23, 309-318 (2005).
- McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane. J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).
- Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin. Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).
