Vi beskriver en protokoll for real-time videoimaging av neuronal migrasjon i musen forebrain. Migreringen av virally-merkede eller podet neuronal forløpere ble registrert i akutte levende stykker med vid-feltet fluorescerende avbildning med en relativt rask oppkjøp intervall å studere de forskjellige faser av celle migrasjon, herunder varighetene av den stasjonære og migrasjon faser og hastigheten migrasjon.
Det er en betydelig mengde bevis som indikerer at nye funksjonelle nerveceller er konstitutivt generert fra en endogen pool av nevrale stamceller i avgrensede områder av den voksne hjernen hos pattedyr. Nyfødte neuroblasts fra subventricular sone (SVZ) vandrer langs rostral vandrende strøm (RMS) til sin endelige destinasjon i luktelappen (OB) 1. I RMS, neuroblasts migrere tangentielt i kjedene ensheathed etter astrocytic prosesser 2,3 bruker blodkar som en strukturell støtte og en kilde for molekylær faktorer som kreves for migrasjon 4,5. I OB, neuroblasts løsner fra kjedene og migrere radialt inn i de forskjellige slagflaten lagene der de differensieres til interneurons og integrere i eksisterende nettverk 1, 6.
I dette manuskriptet beskriver vi fremgangsmåten for overvåking cellemigrering i akutte stykker av gnager hjernen. Bruken av akutte stykker lar assessment av cellemigrering i mikromiljøet som tett ligner til in vivo forhold og i hjernen som er vanskelig å få tilgang til for in vivo avbildning. I tillegg unngår den lang dyrking stand som i tilfelle av organotypic og cellekulturer som kan til slutt endre migrasjon egenskapene til cellene. Neuronal forløpere i akutte skiver kan visualiseres ved hjelp av DIC optikk eller fluorescerende proteiner. Viral merking av nevrale forløpere i SVZ, pode neuroblasts fra reporter mus i SVZ av vill-type mus, og bruker transgene mus som uttrykker fluorescerende protein i neuroblasts er alle egnede metoder for å visualisere neuroblasts og følge deres migrasjon. Den senere fremgangsmåte er imidlertid ikke tillater enkeltceller spores over lengre tid på grunn av den høye tettheten av merkede celler. Vi brukte et bredt felt fluorescerende oppreist mikroskop utstyrt med et CCD-kamera for å oppnå en relativt hurtig oppkjøp intervall (en image hver 15 eller 30 sek) for å pålitelig identifisere den stasjonære og trekkende faser. En presis identifisering av varigheten av de stasjonære og vandrende faser er avgjørende for entydig tolkning av resultatene. Vi har også utført flere z-trinn oppkjøp for å overvåke neuroblasts migrasjon i 3D. Wide-field fluorescerende imaging har blitt brukt mye til å visualisere neuronal migrasjon 7-10. Her beskriver vi detaljert protokoll for merking neuroblasts, utføre real-time video-avbildning av neuroblast migrasjon i akutte skiver av den voksne mus forebrain, og analysere celle migrasjon. Mens den beskrevne protokoll eksemplifiseres migrering av neuroblasts i den voksne RMS, kan den også brukes til å følge cellemigrering i embryonale og tidlig postnatale hjerner.
Riktig målretting av nevrale forløpere til de aktuelle områder av hjernen er en fundamental prosess underliggende riktig montering og funksjon av nevrale kretser. Det store flertallet av cellene vandrer under embryonal utvikling og postnatal hjernen bare i noen få regioner, slik som OB, dentate gyrus og lillehjernen, neuronal forskyvning fortsatt finner sted. Mekanismene orkestrering celle migrasjon i postnatal hjernen gjenstår imidlertid, dårlig forstått. Kunnskap om de mekanismer og molekylære stier involvert …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av en kanadiske Institutes of Health Research (CIHR) tilskudd til ASJK ble delvis støttet av en Université Laval fellesskap. AS er mottaker av en Canada Research Chair i postnatal neurogenesis.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Sucrose | Sigma | S9378 |
Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
NaCI | Sigma | S9625 |
KCI | Sigma | P9541 |
MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
NaHCO3 | Sigma | S5761 |
NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
HEPES | Sigma | H3375 |
HBSS | Gibco | 14170-112 |
DNase I | Sigma | D-5025 |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
BSA | EMD | 2930 |
Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
Suture | Stoelting | 50487 |
Anafen | CDMV | 11508 |
20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
Petri dish | VWR | 25384-094 |
Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
Glue | Permabond | 910 |
95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
Blade | WPI | 501901 |
Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
Micro drill system | WPI | 501819 |
Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |