Time-lapse Imaging av Neuroblast Migrasjon i Akutt Skiver av Adult Mouse forebrain

Det er en betydelig mengde bevis som indikerer at nye funksjonelle nerveceller er konstitutivt generert fra en endogen pool av nevrale stamceller i avgrensede områder av den voksne hjernen hos pattedyr. Nyfødte neuroblasts fra subventricular sone (SVZ) vandrer langs rostral vandrende strøm (RMS) til sin endelige destinasjon i luktelappen (OB) ^1. I RMS, neuroblasts migrere tangentielt i kjedene ensheathed etter astrocytic prosesser ^2,3 bruker blodkar som en strukturell støtte og en kilde for molekylær faktorer som kreves for migrasjon ^4,5. I OB, neuroblasts løsner fra kjedene og migrere radialt inn i de forskjellige slagflaten lagene der de differensieres til interneurons og integrere i eksisterende nettverk ^{1, 6.}

I dette manuskriptet beskriver vi fremgangsmåten for overvåking cellemigrering i akutte stykker av gnager hjernen. Bruken av akutte stykker lar assessment av cellemigrering i mikromiljøet som tett ligner til in vivo forhold og i hjernen som er vanskelig å få tilgang til for in vivo avbildning. I tillegg unngår den lang dyrking stand som i tilfelle av organotypic og cellekulturer som kan til slutt endre migrasjon egenskapene til cellene. Neuronal forløpere i akutte skiver kan visualiseres ved hjelp av DIC optikk eller fluorescerende proteiner. Viral merking av nevrale forløpere i SVZ, pode neuroblasts fra reporter mus i SVZ av vill-type mus, og bruker transgene mus som uttrykker fluorescerende protein i neuroblasts er alle egnede metoder for å visualisere neuroblasts og følge deres migrasjon. Den senere fremgangsmåte er imidlertid ikke tillater enkeltceller spores over lengre tid på grunn av den høye tettheten av merkede celler. Vi brukte et bredt felt fluorescerende oppreist mikroskop utstyrt med et CCD-kamera for å oppnå en relativt hurtig oppkjøp intervall (en image hver 15 eller 30 sek) for å pålitelig identifisere den stasjonære og trekkende faser. En presis identifisering av varigheten av de stasjonære og vandrende faser er avgjørende for entydig tolkning av resultatene. Vi har også utført flere z-trinn oppkjøp for å overvåke neuroblasts migrasjon i 3D. Wide-field fluorescerende imaging har blitt brukt mye til å visualisere neuronal migrasjon ^7-10. Her beskriver vi detaljert protokoll for merking neuroblasts, utføre real-time video-avbildning av neuroblast migrasjon i akutte skiver av den voksne mus forebrain, og analysere celle migrasjon. Mens den beskrevne protokoll eksemplifiseres migrering av neuroblasts i den voksne RMS, kan den også brukes til å følge cellemigrering i embryonale og tidlig postnatale hjerner.