الوقت الفاصل بين التصوير للهجرة أرومة عصبية في شرائح الدماغ الأمامي الحاد للماوس الكبار
Summary
وصفنا بروتوكول للفي الوقت الحقيقي videoimaging للهجرة الخلايا العصبية في الدماغ الأمامي الماوس. وسجلت هجرة الخلايا العصبية السلائف فيروسي أو المطعمة التي تحمل علامات في حي شرائح واسعة باستخدام الحاد مجال التصوير الفلورسنت مع فاصل زمني سريع نسبيا اقتناء لدراسة المراحل المختلفة للهجرة الخلايا، بما في ذلك فترات من مراحل ثابتة والهجرة وسرعة الهجرة.
Abstract
هناك مجموعة كبيرة من الأدلة تشير إلى أن يتم إنشاء جوهري الخلايا العصبية وظيفية جديدة من حمام سباحة داخلي المنشأ من الخلايا الجذعية العصبية في المناطق المحظورة من الدماغ الثدييات الكبار. neuroblasts حديثي الولادة من منطقة subventricular (SVZ) تهاجر على طول مجرى منقاري المهاجرة (RMS) إلى وجهتها النهائية في البصلة الشمية (OB) 1. في RMS، neuroblasts ترحيل عرضية في سلاسل مغمد من خلال عمليات نجمي 2،3 باستخدام الأوعية الدموية كوسيلة لدعم الهيكلية ومصدر من العوامل الجزيئية اللازمة للهجرة 4،5. في OB، neuroblasts فصل من سلاسل وترحيل شعاعيا في طبقات مختلفة بصلي حيث تفرق في interneurons والاندماج في الشبكة القائمة 1 و 6.
في هذا المخطوط وصفنا إجراءات الهجرة خلية الرصد في شرائح حاد في الدماغ القوارض. استخدام شرائح الحادة يسمح للassessmالأنف والحنجرة الهجرة خلية في المكروية التي تشبه ارتباطا وثيقا في ظروف المجراة في مناطق الدماغ التي يصعب الوصول إليها لفي الجسم الحي التصوير. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتجنب حالة زراعة طويلة كما في حالة الثقافات عضوي النمط والخلية التي قد تغير في نهاية المطاف خصائص هجرة الخلايا. يمكن السلائف الخلايا العصبية الحادة في شرائح تصور باستخدام البصريات DIC أو البروتينات الفلورية. وضع العلامات الفيروسية السلائف الخلايا العصبية في SVZ، تطعيم neuroblasts من الفئران مراسل في SVZ من البرية من نوع الفئران، والفئران المعدلة وراثيا باستخدام البروتين التي تعبر عن الفلورية في neuroblasts كلها أساليب مناسبة لتصور neuroblasts وبعد هجرتهم. الأسلوب في وقت لاحق، ومع ذلك، لا يسمح لتعقبها الخلايا الفردية لفترات طويلة من الوقت بسبب كثافة عالية من الخلايا المسمى. استخدمنا اسعة المجال المجهر تستقيم الفلورسنت مجهزة الكاميرا CCD لتحقيق فاصل زمني سريع نسبيا اقتناء (واحد IMAجنرال الكتريك كل ثانية 15 أو 30) لتحديد موثوق ثابتة ومراحل المهاجرة. A تحديد دقيق للمدة الأطوار الثابتة والمهاجرة أمر حاسم لا لبس فيه لتفسير النتائج. ونحن أيضا تنفيذ عدة عمليات الاستحواذ خطوة Z-لرصد neuroblasts الهجرة في 3D. وقد استخدم على نطاق واسع مجال التصوير الفلورسنت لتصور الهجرة العصبية 7-10. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لوصفها neuroblasts، وأداء الفيديو في الوقت الحقيقي التصوير الهجرة أرومة عصبية حادة في شرائح من الدماغ الأمامي الماوس الكبار، وتحليل الهجرة الخلية. في حين أن البروتوكول وصف مثالا للهجرة neuroblasts في RMS الكبار، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لمتابعة الهجرة خلية في المخ بعد الولادة الجنينية والمبكر.
Protocol
Discussion
استهداف الصحيح السلائف الخلايا العصبية إلى مناطق الدماغ المناسب هو عملية الأساسية التي تقوم عليها الجمعية السليم وظيفة الدارات العصبية. الغالبية العظمى من الخلايا تهاجر أثناء التطور الجنيني وبعد الولادة في الدماغ إلا في مناطق قليلة، مثل التلفيف، OB المسنن والمخيخ،…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الكندية منحة الصحة (CIHR) بحوث لASJK كان مدعوما جزئيا زمالة جامعة لافال. وكما هو حاصل على كرسي أبحاث كندا في تكوين الخلايا العصبية بعد الولادة.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
| NaCI | Sigma | S9625 |
| KCI | Sigma | P9541 |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| HBSS | Gibco | 14170-112 |
| DNase I | Sigma | D-5025 |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| BSA | EMD | 2930 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
| Suture | Stoelting | 50487 |
| Anafen | CDMV | 11508 |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
| Petri dish | VWR | 25384-094 |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
| Glue | Permabond | 910 |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
| Blade | WPI | 501901 |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
| Micro drill system | WPI | 501819 |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
Referências
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. 67, 213-223 (2010).
- Lois, C., Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science. 264, 1145-1148 (1994).
- Snapyan, M. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
- Lledo, P. M., Saghatelyan, A. Integrating new neurons into the adult olfactory bulb: joining the network, life-death decisions, and the effects of sensory experience. Trends Neurosci. 28, 248-254 (2005).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA release and uptake regulate neuronal precursor migration in the postnatal subventricular zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J. Neurosci. 30, 8660-8670 (2010).
- Murase, S., Horwitz, A. F. Deleted in colorectal carcinoma and differentially expressed integrins mediate the directional migration of neural precursors in the rostral migratory stream. J. Neurosci. 22, 3568-3579 (2002).
- Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord. Development. 134, 1943-1954 (2007).
- Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties. Neurosci. Res. 51, 475-492 (2005).
- Bozoyan, L., Khlghatyan, J., Saghatelyan, A. Astrocytes Control the Development of the Migration-Promoting Vasculature Scaffold in the Postnatal Brain via VEGF Signaling. J. Neurosci. 32, 1687-1704 (2012).
- Bovetti, S. Blood vessels form a scaffold for neuroblast migration in the adult olfactory bulb. J. Neurosci. 27, 5976-5980 (2007).
- Platel, J. C., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in whole-mounts of the subventricular zone. J. Physiol. 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Kim, Y., Comte, I., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Adult mouse subventricular zone stem and progenitor cells are sessile and epidermal growth factor receptor negatively regulates neuroblast migration. PLoS One. 4, e8122 (2009).
- Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62, 53-71 (2009).
- Comte, I. Galectin-3 maintains cell motility from the subventricular zone to the olfactory bulb. J. Cell Sci. 124, 2438-2447 (2011).
