Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes
Summary
Nous décrivons un protocole en temps réel videoimaging de la migration neuronale dans le cerveau antérieur de la souris. La migration de viralement étiquetés ou greffés précurseurs neuronales a été enregistré en direct en utilisant des tranches aiguës imagerie à grand champ fluorescent avec un intervalle d'acquisition relativement rapide pour étudier les différentes phases de la migration cellulaire, y compris les durées des phases stationnaire et la migration et la vitesse de migration.
Abstract
Il existe un ensemble considérable de preuves indiquant que les nouveaux neurones fonctionnels sont constitutivement produite à partir d'une piscine endogène des cellules souches neurales dans des zones restreintes du cerveau des mammifères adultes. Neuroblastes nés de la zone sous-ventriculaire (SVZ) migrent le long du courant de migration rostrale (RMS) vers leur destination finale dans le bulbe olfactif (OB) 1. Dans la RMS, neuroblastes migrent tangentiellement dans les chaînes entourées par des processus astrocytaires 2,3 à l'aide des vaisseaux sanguins comme un support structurel et une source de facteurs moléculaires nécessaires à la migration 4,5. Dans l'OB, les neuroblastes se détacher des chaînes et migrent radialement dans les différentes couches bulbaires où ils se différencient en interneurones et à s'intégrer dans le réseau existant 1, 6.
Dans ce manuscrit, nous décrivons la procédure de migration des cellules de suivi en tranches aiguës du cerveau des rongeurs. L'utilisation des tranches aiguës permet à l'assessment de la migration cellulaire dans le microenvironnement ressemblant à des conditions in vivo et dans les régions du cerveau qui sont difficiles d'accès pour l'imagerie de vivo. En outre, il évite état de culture autant que dans le cas des cultures organotypiques et de la cellule, qui peut éventuellement modifier les propriétés de migration des cellules. Précurseurs neuronaux en tranches aiguës peuvent être visualisés en utilisant l'optique DIC ou des protéines fluorescentes. Étiquetage virale des précurseurs neuronaux dans la SVZ, la greffe neuroblastes de souris journaliste dans la SVZ de souris de type sauvage, et en utilisant des souris transgéniques qui expriment une protéine fluorescente dans les neuroblastes sont toutes des méthodes appropriées pour la visualisation des neuroblastes et après leur migration. La méthode plus tard, cependant, ne permet pas de cellules individuelles à suivre pendant de longues périodes de temps en raison de la forte densité de cellules marquées. On utilise un grand champ du microscope à fluorescence vertical équipé d'une caméra CCD pour obtenir un intervalle d'acquisition relativement rapide (une image toutes les 15 secondes ou 30) pour identifier de manière fiable les phases stationnaire et migrateurs. Une identification précise de la durée des phases stationnaires et migrateurs est cruciale pour l'interprétation univoque des résultats. Nous avons également réalisé plusieurs acquisitions progressives z pour surveiller la migration des neuroblastes en 3D. Imagerie à grand champ fluorescente a été largement utilisé pour visualiser la migration neuronale 7-10. Ici, nous décrivons le protocole détaillé pour l'étiquetage des neuroblastes, l'exécution en temps réel de vidéo-imagerie de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur de souris adulte, et l'analyse de la migration cellulaire. Alors que le protocole décrit exemple la migration des neuroblastes dans le RMS adulte, elle peut également être utilisée pour suivre la migration des cellules embryonnaires dans le cerveau et le début postnatal.
Protocol
Discussion
Le ciblage correct des précurseurs neuronaux pour les régions du cerveau appropriés est un processus fondamental qui sous-tend l'ensemble et le bon fonctionnement des circuits neuronaux. La grande majorité des cellules migrent pendant le développement embryonnaire et dans le cerveau postnatal seulement dans quelques régions, comme l'OB, le gyrus denté et le cervelet, le déplacement neuronale a toujours lieu. Les mécanismes orchestrant la migration des cellules dans le cerveau postnatal reste cependant m…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) subvention pour ASJK a été partiellement financé par une bourse de l'Université Laval. AS est le titulaire d'une chaire de recherche du Canada en neurogenèse postnatale.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sucrose | Sigma | S9378 |
| Glucose (ACSF) | EMD | DX0145-3 |
| NaCI | Sigma | S9625 |
| KCI | Sigma | P9541 |
| MgCI2x6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 |
| NaH2PO4xH2O | EMD | SX0710-1 |
| CaCI2x2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 |
| Glucose (40X solution) | Sigma | G8769 |
| Sodium pyruvat | Gibco | 11360-070 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| HBSS | Gibco | 14170-112 |
| DNase I | Sigma | D-5025 |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| BSA | EMD | 2930 |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 |
| Ketamine/Xylazine | CDMV | 5230 |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-380 |
| 15 ml conical tube | Sarstedt | 62.553.205 |
| 50 ml conical tube | Sarstedt | 62.547.205 |
| Glass capillaries (stereotaxic injection) | WPI | 4878 |
| Paraffin oil | EMD | PX0045-3 |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 |
| Suture | Stoelting | 50487 |
| Anafen | CDMV | 11508 |
| 20 cc Syringe | VWR | SS-20L2 |
| Petri dish | VWR | 25384-094 |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 |
| Glue | Permabond | 910 |
| 95% O2/5% CO2 | Linde | 24068835 |
| Blade | WPI | 501901 |
| Nylon mesh | Warner Instruments | 64-0198 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 000.019 |
| Pipette puller | Sutter Instrument | P-97 |
| Nanoliter injector | WPI | B203MC4 |
| Stereotaxic injection apparatus | WPI | 502900 |
| Micro drill system | WPI | 501819 |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 |
| Wide-field fluorescent microscope | Olympus | BX61WIF |
| CCD camera | Photometrics | CS-HQ2-D |
| Ultra-quiet imaging chamber | Harvard Apparatus | 64-1487 |
| PH-1 Series 20 heater platform | Harvard Apparatus | 64-0284 |
| Heating system | Warner Instruments | TC-344B |
| 40X water immersion objective | Olympus | 1-UM587 |
| 10X water immersion objective | Olympus | 1-UM583 |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
Referências
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