Producción eficiente de parvovirus recombinante con la ayuda de derivados de adenovirus-Systems

Parvovirus roedores (PV), tales como ratas H-1PV y MVM, son pequeñas, simples virus icosaédricas transición a la competencia, el ADN. Su genoma incluye dos promotores P4 y P38 que regulan la expresión de proteínas no estructurales (NS1 y NS2) y cápside (VP1 y VP2), respectivamente ^1. Ellos atraen el interés de alta como agentes contra el cáncer para sus habilidades y oncolíticos oncosuppressive al tiempo que no patógeno para los seres humanos ^2. NS1 es el efector principal de ³ citotoxicidad viral. Con el fin de mejorar aún más sus actividades antineoplásicos naturales, derivados de estos vectores se han generado mediante la sustitución del gen que codifica para las proteínas de la cápside con un transgén terapéutico (por ejemplo, un polipéptido citotóxico, citoquinas, quimioquinas, gen supresor tumoral, etc) ^4. Los parvovirus recombinantes (recPVs) vector retiene las secuencias NS1 / 2 de codificación y los telómeros genoma fotovoltaicos que son necesarias para la amplificación del ADN viral y el envasado. Producción derecPVs se produce sólo en las células productoras (generalmente HEK293T), por la co-transfección de las células con un segundo vector (pCMV-VP) que expresan el gen que codifica para las proteínas VP (fig. 1) ^4. Los vectores recPV generadas de esta manera son replicación defectuosa. Aunque recPVs demostrado poseer actividades mejoradas oncotoxic con respecto a los virus parentales de los que han sido generadas, su producción sigue siendo un reto importante y fuertemente obstaculiza el uso de estos agentes anti-cáncer en aplicaciones clínicas.

Hemos encontrado que la introducción de un vector de Ad-5 que contiene el derivado E2a, E4 (orf6) y los genes VA RNA (por ejemplo pXX6 plásmido) en HEK293T mejoró la producción de recPVs por más de 10 veces en comparación con otros protocolos en uso. Con base en este hallazgo, hemos construido una novela Ad-VP-helper que contiene los elementos genómicos adenovirales necesarias para aumentar la producción de recPVs así como la parvovirnos VP gen la unidad ^5. El uso de Ad-VP-ayudante, permite la producción de reco-PV usando un protocolo que se basa enteramente en los pasos infección viral (en oposición a la transfección del plásmido), lo que hace posible el uso de líneas celulares que son difíciles de transfectar (por ejemplo, NB324K) ( fig. 2). Se presenta un método que mejora enormemente la cantidad de virus recombinante producida, reduciendo tanto el tiempo de producción y los costes, sin afectar la calidad del producto final ^5. Además, la producción a gran escala de recPV (en células en suspensión y biorreactores) es ahora concebible.