Summary

Эффективное производство рекомбинантных парвовирус с помощью аденовируса производные системы

Published: April 23, 2012
doi:

Summary

Здесь мы опишем протокол, основанный только на клеточных инфекций, что повышает эффективность рекомбинантного парвовирус более чем в 100 раз по сравнению с другими протоколами в использовании. Этот протокол основан на использовании новых аденовирус 5-помощник на основе содержащий транскрипцию парвовирус В.П. единицы (Ad-VP).

Abstract

Грызун парвовирусов (PV), таких как крысы H-1PV и MVM, малы икосаэдра, одноцепочечной, вирусов ДНК. Их геном состоит из двух промоутеров P4 и P38, которые регулируют экспрессию неструктурных (NS1 и NS2) и капсид белков (VP1 и VP2), соответственно 1. Они привлекают большой интерес в качестве противоопухолевого средства для их онколитических и oncosuppressive способности в то же время, не патогенных для человека 2. NS1 является основным эффекторных вирусных 3 цитотоксичности. В целях дальнейшего повышения их естественной противоопухолевой деятельности, производные от этих векторов были получены заменой ген, кодирующий белки капсида с терапевтическим трансгенов (например, цитотоксический полипептид, цитокинов, хемокинов, гена супрессора опухоли и т.д.) 4. Рекомбинантный парвовирусов (recPVs) вектор сохраняет NS1 / 2 кодирующих последовательностей генома и PV теломеры, которые необходимы для вирусной амплификации ДНК и упаковки. ПроизводствоrecPVs происходит только в клетках производителей (как правило, HEK293T), по совместной трансфекции клеток со второй вектор (pCMV-VP), выражающая ген, кодирующий В.П. белков (рис. 1) 4. RecPV векторов, таким образом, являются репликации неисправен. Хотя recPVs оказалось обладают расширенной oncotoxic деятельности по отношению к родительской вирусы, от которых они были получены, их производство остается серьезной проблемой и сильно затрудняет использование этих препаратов в борьбе с раком клинического применения.

Мы обнаружили, что введение Ad-5 производным вектор, содержащий Е2, Е4 (orf6) и VA РНК генов (например, pXX6 плазмиды) в HEK293T улучшить производство recPVs более чем в 10 раз по сравнению с другими протоколами в использовании. На основании этого вывода, мы построили новый Ad-VP-помощник, который содержит геномную аденовирусной элементы, необходимые для повышения recPVs производства, а также parvovirнам вице-президент ген блок 5. Использование Ad-VP-помощником, позволяет производить REC-клипов, используя протокол, который полностью полагается на вирусную инфекцию шаги (в отличие от трансфекции плазмиды), что делает возможным использование клеточных линий, которые являются трудными для трансфекции (например, NB324K) ( Рис. 2). Мы представляем метод, который значительно повышает количество рекомбинантного вируса производства, снижая время и затраты производства, не влияя на качество конечного продукта 5. Кроме того, крупномасштабное производство recPV (в виде суспензии клеток и биореакторы) теперь возможно.

Protocol

Обратите внимание, что лаборатории с уровнем биобезопасности 2, необходимого для производства рекомбинантных парвовирусов (recPV). Протокол, подразделяется на две основные части. В первой части (производство recPV помощью трансфекции) требуется для получения минимального к?…

Discussion

Мы показали, что recPV производства может быть повышена за счет наличия аденовирусной элементов генома. Мы увеличили recPV урожайности более чем в 10 раз (с 0,3 до 5 ТУ / клетку), предоставляя элемент генома аденовируса с помощью трансфекции и более чем в 100 раз совместное заражение клеток с Ad-VP-п?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим команду производство DKFZ вирусов и развитие блока, в частности, Маркус Мюллер, Сильвия Münstermann, Барбара Liebetrau, и Мэнди Рошер. Это исследование было частично поддержано грантами от Федерального министерства образования и научных исследований (BMBF) и Гельмгольца в рамках Немецкого Krebsforschungszentrum / Cancéropôle дю Гран-Est совместные программы в прикладной вирусологии опухолей.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
DMEM Sigma D5796
MEM Sigma M4655
Foetal Bovine Serum PAA A15-101
L-Glutamine Gibco 25030-024
Fugene Roche 047097050001
Trypsin-EDTA Invitrogen 25300062
Benzonase Nuclease Sigma E8263
Adeno-X Rapid Titer Kit Clontech 632250

Referências

  1. Cotmore, S. F., Tattersall, P. Parvoviral host range and cell entry mechanisms. Adv. Virus. Res. 70, 183 (2007).
  2. Rommelaere, J. Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine Growth Factor Rev. 21, 185 (2010).
  3. Hristov, G. Through Its Nonstructural Protein NS1, Parvovirus H-1 Induces Apoptosis via Accumulation of Reactive Oxygen Species. J. Virol. 84, 5909-5909 (2010).
  4. Cornelis, J. J., Salome, N., Dinsart, C., Rommelaere, J. Vectors based on autonomous parvoviruses: novel tools to treat cancer. J. Virol. 6, 193-193 (2004).
  5. El-Andaloussi, N. Novel adenovirus-based helper system to support production of recombinant parvovirus. Cancer Gene Ther. 18, (2011).
  6. Kestler, J. cis requirements for the efficient production of recombinant DNA vectors based on autonomous parvoviruses. Hum. Gene. Ther. 10, 1619-1619 (1999).
  7. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. J. Virol. 72, 2224 (1998).
  8. He, T. C. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 2509 (1998).
  9. Zolotukhin, S. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene. Ther. 6, 973 (1999).
  10. Maxwell, F., Harrison, G. S., Maxwell, I. H. Improved production of recombinant AAV by transient transfection of NB324K cells using electroporation. J. Virol. Methods. 63, 129 (1997).
  11. Wrzesinski, C. Chimeric and pseudotyped parvoviruses minimize the contamination of recombinant stocks with replication-competent viruses and identify a DNA sequence that restricts parvovirus H-1 in mouse cells. J. Virol. 77, 3851 (2003).

Play Video

Citar este artigo
El-Andaloussi, N., Leuchs, B., Bonifati, S., Rommelaere, J., Marchini, A. Efficient Recombinant Parvovirus Production with the Help of Adenovirus-derived Systems. J. Vis. Exp. (62), e3518, doi:10.3791/3518 (2012).

View Video