아데노 바이러스 파생 시스템의 도움으로 효율적인 재조합 파르 보 바이러스 생산
Summary
여기에는 오직 사용중인 다른 프로토콜에 비해 100 개 이상의 배 이상에 의한 재조합 파르 보 바이러스 생산의 효율성을 향상시켜 세포 감염에 기반 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 파르 보 바이러스의 부사장의 전송 단위 (광고-VP)를 포함하는 5-기반 도우미 소설 아데노 바이러스의 사용에 의존하고 있습니다.
Abstract
같은 쥐 H-1PV 및 MVM 등 설치류의 parvoviruses은 (PV), 작은 icosahedral, 단일 좌초된, DNA 바이러스입니다. 그들의 게놈은 각각 한 비 구조 (NS1과 NS2)과 capsid 단백질 (VP1과 VP2)의 표현을 조절이 발기인 P4와 P38을 포함합니다. 그들은 oncolytic 및 oncosuppressive 능력에 대한 anticancer 대리인의 인간 2 비 병원성하면서로서 높은 관심을 끌. NS1 바이러스는 세포 독성의 3 대 이펙터입니다. 추가로 천연 antineoplastic 활동을 강화하기 위해서는 이러한 벡터로부터 파생은 치료 transgene (예 : 세포 독성 폴리펩티드, 시토킨, 케모카인, 종양 억제 유전자 등) 4 capsid 단백질에 대한 유전자 인코딩 교체에 의해 생성되었습니다. 재조합 parvoviruses (recPVs)는 벡터가 NS1 / 2 코딩 시퀀스 및 바이러스성 DNA의 증폭 및 패키징에 필요한 PV의 게놈 telomeres을 유지합니다. 생산recPVs 단지별로 생산 세포 (일반적으로 HEK293T)에서 발생하는 공동 transfecting 부사장 단백질에 대한 유전자 인코딩 (그림 1) 4을 표현 두 번째 벡터 (pCMV-VP)으로 세포를. 이렇게 생성된 recPV 벡터는 복제에 결함이 있습니다. recPVs 그들이 생성되어있는 부모의 바이러스에 대하여 강화된 oncotoxic 활동을 소유 입증했지만, 그들의 생산을 주요 과제 남아 강력하게 안티 – 암 임상 응용에 이러한 에이전트의 사용을 hampers.
우리가 사용하는 다른 프로토콜에 비해 이상 10 배 이상으로 recPVs의 생산을 향상 HEK293T로 E2a, E4 (orf6) 및 VA RNA의 유전자 (예 : pXX6 플라스미드)를 포함하는 광고-5 파생된 벡터의 도입을 발견. 이 연구 결과를 바탕으로, 우리는 recPVs 생산을 강화하는 데 필요한 게놈 adenoviral 요소뿐만 아니라 parvovir 포함되어 AD-VP-헬퍼 소설을 만들었저희 부사장 유전자 단위 5. AD-VP-헬퍼의 사용은, 레크 리에 – 베트남 후 증후군의 생산 ((예 NB324K) 가능 transfect하기 어려운 세포 라인의 활용, 바이러스성 감염 단계 (같은 플라스미드 transfection 반대)에 전적으로 의존 프로토콜을 사용하여 수 그림. 2). 우리는 크게 최종 제품 5 품질에 영향을 미치지 않고, 생산 시간 및 비용을 모두 절감, 생산 재조합 바이러스의 양을 향상 방법을 제시한다. 또한, recPV의 대규모 생산은 (현탁액 세포와 bioreactors에서) 지금 생각할 수있다.
Protocol
Discussion
우리는 recPV 생산은 adenoviral 게놈 요소의 존재에 의해 향상될 수있는 것으로 나타났습니다. 우리는 transfection 통해 아데노 바이러스 게놈 요소를 제공함으로써 관련 recPV와 함께 광고 – 부사장 – 도우미와 100 개 이상의 접이식 공동 감염 세포에 의해 10 개 이상의 배 (0.3-5 TU / 셀)에 의해 recPV 수율을 증가 기존의 프로토콜에 비해. 프로토콜은 더욱 아데노 바이러스 게놈 요소의 전달 및 감염에 사용하?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 특히 마커스 뮐러, 실비아 Münstermann, 바바라 Liebetrau와 맨디 Roscher에서 DKFZ 바이러스 생산과 개발 단위의 팀을 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 교육과 연구 (BMBF)와 Deutsches Krebsforschungszentrum / Cancéropôle 뒤 그랜드 – 예상 응용 Tumour 바이러스학의 공동 프로그램의 프레임 워크의 Helmholtz 협회의 연방 교육부에서 교부금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| DMEM | Sigma | D5796 |
| MEM | Sigma | M4655 |
| Foetal Bovine Serum | PAA | A15-101 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 |
| Fugene | Roche | 047097050001 |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300062 |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263 |
| Adeno-X Rapid Titer Kit | Clontech | 632250 |
Referências
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