Раздевания является важным шагом на ранней стадии ВИЧ-1, жизненного цикла и определяется как разборку капсида оболочки и высвобождение вирусного комплекс рибонуклеопротеидных (vRNP). Здесь мы демонстрируем методы выделения нетронутыми ядер от ВИЧ-1 вирионов и для количественного их раздевания<em> В пробирке</em>.
Геном ретровируса заключен в капсид окружен липидной оболочкой. Для лентивирусов, таких как ВИЧ-1, конической оболочки капсида состоит из белка CA расположены в виде решетки из шестиугольника. Капсида закрыто 7 пентамеры на широком конце и 5 на узкий конец конуса 1, 2. Заключенная в этой оболочки капсида является вирусный комплекс рибонуклеопротеидных, а вместе они составляют ядро.
После слияния вирусной мембраны с мембраной клетки-мишени, ВИЧ-1 поступает в цитоплазму. Капсида то разбирает освобождения свободного ЦА в растворимой форме 3 в процесс называется раздевания. Внутриклеточные места и времени проведения ВИЧ-1 раздевания мало изучены. Одноместный аминокислотных замен в ЦА, которые изменяют стабильность капсида также ослабить способность ВИЧ-1, чтобы инфицировать клетки 4. Это означает, что стабильность капсид имеет решающее значение для ВИЧ-1 инфекции. </p>
ВИЧ-1 раздевания было трудно учиться из-за отсутствия свободных мест в чувствительных и надежных тестов для этого процесса. Здесь мы опишем количественный метод исследования раздевания в пробирке использованием ядра изолированы от инфекционных ВИЧ-1 частиц. Подход предполагает выделение ядер путем осаждения концентрированных вирионов через слой моющего средства и в линейный градиент сахарозы, в холод. Для количественной оценки раздевания, изолированных ядер инкубируют при 37 ° С для различных определенные интервалы времени, а затем осаждали ультрацентрифугирования. Степень раздевания анализируется количественная доля ЦА в супернатант. Этот подход был применен для анализа последствий вирусных мутаций на ВИЧ-1 капсида стабильности 4, 5, 6. Следует также полезны для изучения роли клеточных факторов ВИЧ-1 раздевания.
Метод, описанный здесь, чтобы очистить ВИЧ-1 ядер для изучения раздевания в пробирке полезна для изучения этой стадии ВИЧ-1 жизненного цикла, особенно из-за отсутствия утвержденным методом для анализа на ВИЧ-1 раздевания в клетках-мишенях. Хотя этот метод использует равновесия ультрацен…
The authors have nothing to disclose.
ВИЧ-1 раздевания исследования в лаборатории Эйкена были поддержаны грантами NIH AI40364, AI50423 и AI076121. Несколько ключевых материалов, в том числе реагенты, используемые в p24 ELISA, были предоставлены NIH исследований СПИДа и справочные программы, Отдел СПИДа, NIAID, NIH.
Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |