HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で
Summary
脱殻は、HIV – 1のライフサイクルの初期段階に必須の工程であるとカプシド殻の分解とウイルスリボ核タンパク質複合体（vRNP）のリリースとして定義されています。ここで、我々はHIV – 1ビリオンから無傷のコアを分離するためと、その脱殻を定量化するための手法を示します<em> in vitroで</em>。
Abstract
レトロウイルスのゲノムは、脂質エンベロープに囲まれたカプシドに包まれています。このようなHIV – 1のようなレンチウイルス、の場合は、円錐形のカプシドの殻は、六角形の格子として配置されたCAのタンパク質で構成されています。カプシドはコーン1、2の狭い方の端で7広い端の五量体と5でクローズされます。このカプシドの殻で覆われて、ウイルスリボ核タンパク質複合体である、と一緒に彼らは、コアを備える。
標的細胞膜とウイルス膜の融合に続いて、HIV – 1は細胞質に放出される。カプシドは、脱殻と呼ばれるプロセスで可溶性の形態3にフリーCAを解放逆アセンブルします。 HIV – 1脱殻の細胞内の場所とタイミングはよくわかっていない。キャプシドの安定性を変更するカリフォルニア州の単一アミノ酸置換はまた、細胞4を感染させるHIV – 1の能力を損なう。これは、カプシドの安定性は、HIV – 1感染に重要であることを示しています。 </p>
HIV – 1脱殻は、このプロセスのための高感度かつ信頼性の高いアッセイの可用性の不足のために勉強することは困難であった。ここでは、感染性HIV – 1粒子から分離されたコアを用いてインビトロで脱殻を研究するための定量的な方法を説明します。アプローチは、寒さで、洗剤の層を通って直線スクロース勾配に集中ビリオンの沈降によってコアの分離を行います。脱殻を定量するために、分離されたコアは37℃でインキュベートする·さまざまな時間間隔および超遠心分離によって、その後ペレット化のためのC。脱殻の範囲は、上清に、CAの割合を定量することによって分析されます。このアプローチは、HIV – 1キャプシドの安定性4、5、6のウイルス変異の影響を分析するために採用されています。また、HIV – 1の脱殻の細胞因子の役割を研究するために有用でなければなりません。
Protocol
Discussion
方法は、標的細胞にHIV – 1脱殻を分析するために、検証方法の無効性が、特にためにHIV – 1のライフサイクルのこの段階を、研究するための有用なin vitroで脱外勉強するHIV – 1のコアを浄化するためにここで説明する。このメソッドはコアを浄化するために平衡超遠心分離を使用していますが、その他は1％トリトン- X – 100 12、13または0.1％のTriton – X – 100 14、15に重ねショ糖クッシ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
HIV – 1エイケン実験室での脱殻の研究は、NIHの助成金AI40364、AI50423とAI076121によってサポートされていました。 P24 ELISAで使用される試薬を含む、いくつかの重要な材料は、、NIH AIDSリサーチ＆リファレンスプログラム、エイズの部、NIAID、NIHによって提供されていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments (optional) |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) |
NIH AIDS Research and Reference Reagent Program |
3957 | |
|
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 |
Referências
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