我々は、新生児の心筋細胞と組織工学のためのフィブリンハイドロゲルの構造でカプセル化するための細胞の調製の分離を説明します。我々は、電気刺激と細胞の生存および免疫組織染色により発生する活性力を含む培養期間後に心筋培養組織を分析するための方法を説明します。
三次元ハイドロゲルの環境で培養する細胞は組織工学のための構造を開発するだけでなく、in vitroで種々の培養条件下で細胞応答を研究するための重要なテクニックです。三次元環境では、より密接に細胞が原因で、すべての次元1の機械的および化学的刺激のアプリケーションに、in vivoで観察するものを模倣している。三次元のヒドロゲルは、どちらかのようなPEG – DA 2およびPLGA 3またはそのようなコラーゲン4、ヒアルロン酸5またはフィブリン6,7のような天然のタンパク質の数などの合成高分子から行うことができます。フィブリン、天然由来の血液凝固タンパク質、から作成されたハイドロゲルは、身体の自然な創傷治癒のプロセス8の一部であるメッシュを形成するために重合することができます。フィブリンは、組織工学のために理想的な一時的な足場作り、細胞分解性と潜在的に自家9です。
ここでは、3つの日齢の仔ラットと組織工学のためのフィブリンハイドロゲルの構造でカプセル化するための細胞の調製から詳細に新生児心筋細胞の単離を説明します。新生児の心筋細胞は、心臓組織の形成と工学4のin vitro試験で使用される一般的な細胞源です。フィブリンゲルは、酵素トロンビンと混合フィブリノゲンによって作成されます。トロンビンは、他のモノマー10との相互作用の結合部位を明らかに、フィブリノーゲンからfibrinopeptides FPAとFPBを切断する。これらの相互作用は、単量体は、ヒドロゲルのメッシュを形成する繊維に自己集合させる。この酵素反応のタイミングがフィブリノゲンにトロンビンの比、またはトロンビンへのカルシウムの比率を変えることによって調整できるので、一つは射出成形金型は、異なる形状11,12の数で構築できます。さらに我々は文化は13ゲルを制約する方法により、結果として組織のアライメントを生成することができます。
培養静的条件下での二週間のための工学心臓組織の構成要素の後に、心臓の細胞が構造を改造し始めていると電気的ペーシングの条件6歳未満の収縮力を生成することができます。このプロトコルの一部として、我々はまた、機能的な心筋によって生成されたアクティブな力の分析、最終的な細胞の生存を決定するための電気刺激だけでなく、方法によって構築する(ライブデッド含む培養期間後に心筋の設計組織を分析するための方法を説明します。アッセイ)と収縮(ミオシン重鎖またはMHC)と心筋細胞間の細胞結合(コネキシン43またはCx43)のための重要な典型的なタンパク質の発現と形態を調べるために免疫組織染色。
心筋システムのin vitroモデルにおける一貫性と実行可能な三次元におけるフィブリンゲルの結果の新生児ラット心筋細胞のカプセル化。細胞が捕捉されたとき、彼らは代謝活性と、コンパクト化改造およびネイティブの心臓組織12との一貫性のある細胞外マトリックスを再作成することが可能であるため、フィブリンが望ましい生体材料です。我々は心筋細胞はこの環境で自分自身を整列することを可能にするので、それらの機能は、等方性の組織6に比べてより大きな収縮力で、その結果心筋のより特徴的です。潜在的な治療のアプリケーションでは、それは実行可能性と機能性の両方を促進する物質の中で細胞をカプセル化する必要があります。プロトコルは、3次元の微小環境における心筋細胞の挙動を制御するために、フィブリンネットワークを作成するための効率的かつ正確な手段を示すここで紹介。
いくつかの潜在的な問題は、これらのコンストラクトの作成と培養中に発生する可能性があります。つの潜在的な問題は大幅に構造の機能に影響を与える前に、カプセル化に細胞の生存率の維持、である。努力が分離し、フィブリンゲル内の細胞のカプセル化の間の時間を減らすことによって、分離後の細胞死を制限するためになされるべきである。構文は、厳密なスケジュールで一日おきにメディアを提供する必要があります。さらに、使用されるソリューションのすべてに均一性を確保することが重要です。フィブリノーゲン、トロンビンと細胞の混合物は、異機種環境を生成する場合、ECMを改造する細胞の能力は、機械的に夫婦と契約が潜在的に遮断されていない。エンジニアリング組織の継続性の乱れを防ぐために、構造の注入時の気泡の形成を防止することも重要です。この問題を緩和する一つの方法は、シリンジに構造を作り、ゆっくりと注入する必要以上のゲルを描くです。最後に、一度フィブリンマトリックスが設定されていると24時間培養液中にされている、それはフィブリンゲルの細胞ベースの圧縮を促進するため、リング型の側面から構造を切り離すことが不可欠です。金型の中央に構造を維持すること、ガスと栄養素の交換が容易になります。リングの金型の側面への付着はまた、所望の細胞整列が中断される場合があります。
その意識断頭は国立衛生研究所の両方からのガイドラインの下で承認された方法とアメリカ獣医学協会であるこのプロトコルでは安楽死の方法として使用されている点が重要です。しかし、一部の金融機関は、新生児ラットの断頭続いて麻酔を使用することをお勧めします。それは、摘出した心臓組織/細胞のための低酸素条件下での時間の最小量を保証するため、我々は意識的な斬首を選択している。低酸素の比較的少量では虚血と有意にこのプロトコルの結果に影響を与える可能性のある潜在的に心筋細胞死を、筋細胞につながることができます。
The authors have nothing to disclose.
国立心肺血液研究所(賞#R00HL093358にLDB) – この作品は、国立衛生研究所によってサポートされていました。
Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
---|---|---|---|
Sodium chloride | Sigma | S7653 | PBS |
Potassium chloride | Sigma | P9333 | PBS |
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S7907 | PBS |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | PBS |
Glucose | Sigma | G5400 | Isolation |
hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | Isolation |
fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | Isolation |
large scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | Isolation |
micro-scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | Isolation |
scalpel handle | Fine Science Tools | 10008-13 | Isolation |
scalpel blade | Fisher Scientific | 08-918-5A | Isolation |
Absorbent bench underpad | VWR | 56617-014 | Isolation |
sterile drape | Fisher Scientific | GM42526 | Isolation |
autoclave bag | Fisher | 01-812-54 | Isolation |
gauze pad | Fisher Scientific | 13-761-52 | Isolation |
betadine | Purdue Products | 67618-150-01 | Isolation |
sterile gloves | Fisher Scientific | 19-020 | Isolation |
sterile transfer pipette | Fisher Scientific | 9962 | Isolation |
collagenase | Worthington | CLS2 | Isolation |
Teflon rod 1/4 inch diameter | McMaster-Carr | 8546K11 | Mold part |
Teflon tube 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 8547K31 | Mold part |
Silicone O-Ring 1/4 inch ID, 1/2 inch OD | McMaster-Carr | 9396K204 | Mold part |
Teflon tube 1/4 inch ID, 5/16 inch OD | McMaster-Carr | 52355K14 | Mold part |
Kendall monoject syringes 6cc | Fisher Scientific | 05-561-41 | Mold part |
BD syringe 3cc | Fisher Scientific | 309585 | Mold part |
Bovine Fibrinogen | Sigma | F8630 | Construct |
Bovine Thrombin | Sigma | T7513 | Construct |
1 M HEPES | Sigma | H0887 | Construct |
Sodium Chloride | Sigma | S7653 | Construct |
DMEM | Invitrogen | 10569 | Construct |
Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Construct |
Calcium Chloride | Sigma | 383147 | Construct |
0.2 micron filter | Fisher Scientific | SCGVT05RE | Construct |
40 micron cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-547 | Construct |
0.45 micron bottle top filter | Corning | 430627 | Construct |
glass pre-filter | Millipore | AP2007500 | Construct |
18G 1 1/2 inch long needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Construct |
21G 1 inch needle | Fisher Scientific | 14-826C | Construct |
construct jars | Fisher Scientific | 2116 | Construct |
Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | Media |
horse serum | Sigma | H1138 | Media |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 16000 | Media |
aminocaproic acid | Acros Organics | 103305000 | Media |
ascorbic acid | Sigma | A5960 | Media |
insulin | Sigma | I9278 | Media |
Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Histology |
Optimal cutting temperature (OCT) | Ted Pella | 27050 | Histology |
2-methylbutane | Fisher | 03551-4 | Histology |
Mouse MYH1/2/4/6 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-32732 | Histology |
Rabbit Connexin 43 primary antibody | Cell Signaling Technology | 3512 | Histology |
Dylight 549-conjugated donkey anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-505-151 | Histology |
Dylight 488-conjugated Donke anti-rabbit secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-485-152 | Histology |
Live/dead assay | Invitrogen | L-3224 | Analysis |