1. Neonatale cardiomyocyte isolatie – voorbereiding (dag ervoor) Oplossingen die in deze sectie: PBS-glucose-oplossing, stop media. Bereid een PBS-glucose-oplossing door het toevoegen van 5 ml penicilline-streptomycine (100 eenheden / ml en 100 ug / ml) en 1,98 g glucose tot 250 ml 1x steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en breng oplossing volume tot 500 ml met extra steriel 1x PBS. Bereid stop media door toevoeging van 25 ml FBS en 5 ml van penicilline-streptomycine (zelfde concentratie als boven) op Medium 250ml steriele Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM) en breng het volume op 500 ml met een steriele DMEM voor steriele filtering door een 0,2 micron filter. Steriliseer chirurgische instrumenten die nodig zijn voor de isolatie in autoclaaf: een hemostat, # 5 tang, grote scharen, micro-schaar, scalpel en een handvat (# 4). 2. Neonatale cardiomyocyte isolatie – voorbereiding (dag van de oogst) Zorg ervoor dat de steriliteit te behouden Oplossingen die in deze sectie: PBS-glucose-oplossing, Betadine Voor elk nest, neem dan de twee steriele 100 mm petrischalen, plaats ze in de afzuigkap en vul aan met ~ 10 ml ijskoude PBS-glucose. Deze dient dan te worden geplaatst in een met ijs gevulde emmer met ijs in de steriele cultuur kap. Plaats een bekerglas van 250 ml met 30-40 ml van Betadine in de motorkap. Voeg 50 ml / nest van PBS-glucose in een fles, seal en plaats in een 37 ° C waterbad. Voor elke persoon, plaats een absorberend bankje underpad op de motorkap werkvlak en leg een steriel laken op de top en let niet naar het centrum werkgebied van de steriele laken te raken. Dump de chirurgische instrumenten en een 4 x 4 gaasje op de steriel laken zonder het aanraken van de instrumenten. Open een steriel # 20 scalpel en dump op draperen, opnieuw zorg dat u contact met niet-steriele handschoenen. Neem de pups van de dam en plaats in de ondoorzichtige bak, plaats pups in de kap Trek steriele handschoenen Vouw het gaas in vieren, met klem hemostaat en plaats in de Betadine beker. Zet de scalpel op de scalpel handvat en zet apart. 3. Neonatale cardiomyocyte isolatie – hart dissectie Oplossingen die in deze sectie: Betadine, PBS-glucose-oplossing Pak de pup in de niet-dominante hand door knijpen de huid tussen de schouderbladen tussen duim en wijsvinger. Met behulp van de grote schaar, onthoofden van de pup in een te snijden. Zorg ervoor dat u gesneden uit de rug van de pup naar voren, om ervoor te zorgen dat de wervelkolom volledig is verbroken. Uitstrijkje van de pup de borst met de betadine geweekte gaas. Zet de pup door knijpen de schouderbladen samen. Voer een gedeeltelijke thoracotomie naar het hart bloot te leggen. Verhoog de uitgeoefende druk, daarbij het hart langs de ribben voor scalpular dissectie. Voer de scalpel achter het hart naar de grote vaten te verbreken en verwijder het hart. Plaats het hart in het petrischaaltje met PBS-glucose, dat is op het ijs. Herhaal stappen 1-3 voor elke pup in het nest. 4. Neonatale cardiomyocyte isolatie – myocyte isolatie Oplossingen gemaakt / gebruikt in deze sectie: PBS-glucose-oplossing, collagenase oplossing, stop oplossing Zodra de harten zijn geïsoleerd, eventueel resterende bloed en bindweefsel te verwijderen door spoelen in ijskoud PBS-glucose-oplossing, verwijder dan de top 1 / 3 van het hart om alleen de ventriculaire weefsel en plaats te isoleren in een frisse petrischaal met ijskoude PBS glucose, eerder voorbereid. Voorzichtig gehakt de harten naar ~ 1 kubieke mm met behulp van de micro-schaar en de tang. Neem een steriele transferpipet, sneed het topje met een schaar, zodat de mond van de pipet is ~ 3 mm in diameter. Gebruik de pipet om het weefsel stukken en alle van de oplossing over in een 50 ml conische en leg ze op ijs. Weeg 15.000 eenheden per nestje pups van collagenase type II (eenheden / mg is afhankelijk van het lot) en plaats in de fles van 37 ° C opgewarmd PBS-glucose eerder bereid zijn om collagenase oplossing te creëren. Meng goed en steriel filter in een aparte fles. Plaats terug in de 37 ° C waterbad. Plaats de stop oplossing in de 37 ° C water bad. Laat het gehakt weefsel om zich te vestigen op de bodem van de centrifugebuis. Verwijder de bovenstaande vloeistof totdat het totale volume is ~ 10 ml. Voeg 7 ml collagenase oplossing voor de centrifugebuis. Zet de conische buis met het weefsel stukken en de collagenase in een buis rek op een rondschudapparaat in een 37 ° C incubator of oven. Schakel de schudapparaat op op ongeveer 60 rpm en sluit de deur. Stel een timer voor 7 minuten. Zorg ervoor dat de collagenase bac plaatsk in het waterbad warm te houden. Als de timer afgaat, breng de conische terug in de motorkap. Brengen ook de warme collagenase en stop oplossing in de motorkap. Voorzichtig titreren het weefsel stukken 5-7 keer om ze te breken. Na de titratie, kan de stukken om zich te vestigen op de bodem (2-3 minuten). Aspireren af als een groot deel van het supernatant mogelijk, wat zeer voorzichtig op te zuigen het weefsel stukken. Daarna, voeg 7 ml collagenase oplossing om het weefsel stukken en leg terug in de couveuse op de shaker voor de 7 minuten. Voor elke stap die nog overblijft, zachtjes Titreer daarvoor 10 keer te breken het weefsel stukken. Zodra het weefsel stukken af te wikkelen, trekken de supernatant af en vang het op in een aparte 50 ml conisch. Voeg 7 ml collagenase aan het weefsel stukken en verteren weer voor 7 minuten. Om de supernatant buis, voeg 10 ml stop-oplossing met een andere serologische pipet na elke toevoeging van supernatans van de spijsvertering. Herhaal dit totdat alle collagenase is gebruikt (7 stappen in totaal). Na de laatste stap spijsvertering, neem dan de conische met de cel-oplossing en filtreer door 70μm cel zeef in verse conisch. Spin-cellen neer op 100 gram voor 5 minuten en resuspendeer in 20 ml DMEM worden geteld met behulp van een hemocytometer, en plaats de cellen op ijs. Plaats 50 ul van de cellen in een trypan Blue oplossing (75 ul trypan Blue, 125 ul PBS), goed mengen alvorens 10 pi in de hemocytometer voor het tellen. Levende cellen zijn duidelijk, terwijl dode cellen zijn blauw. Verwachten dat ongeveer 3 miljoen cellen per rat pup, met een levensvatbaarheid van ongeveer 80-90%. 5. Casting fibrinegel bouwt – voorbereiding voor het creëren van fibrine gels (goed gedaan op voorhand) Oplossingen die in deze sectie: fibrinogeen voorraadoplossing, trombine voorraad oplossing, Pluronics oplossing, myocard bouwen media. Bereid een 33 mg / ml stockoplossing van fibrinogeen in 20 mM HEPES buffer in 0,9% zoutoplossing door het langzaam mengen van fibrinogeen in de HEPES gebufferde zoutoplossing gedurende een aantal uren bij 37 ° C. Laat de oplossing een nacht af te wikkelen bij 2-8 ° C. Verwarm de oplossing tot 37 ° C. De oplossing wordt steriel gefiltreerd door een reeks van opeenvolgende filters: 40 um cel filters, 0,45 pm fles top filters met glas pre-filters, en 0,2 micrometer fles top filters met glas pre-filters. De oplossing is in hoeveelheden verdeeld in 1 ml en 3 ml porties en opgeslagen bij -20 ° C. Bereid een 25 U / mL stockoplossing van trombine door het toevoegen van 500 U van trombine tot 18 ml van 0,9% zoutoplossing en 2 ml steriel gedemineraliseerd water, steriel filteren door middel van een 0,2 um filter, aliquot in 500 ul en 250 ul aliquots en bevriezen op -80 ° C. Bereid een 5% w / v Pluronics F-127-oplossing, door het oplossen van 50 g Pluronics F-127-700 ml gedeïoniseerd water. Breng de oplossing volume tot 1L met extra gedeïoniseerd water. Steriel filter met 0,2 um filter. De Pluronics oplossing kan gebruikt worden tot drie keer voordat u als steriel gefilterd na elk gebruik. Bereid myocard construeren media door het toevoegen van 10% paard serum, 2% foetaal runderserum, 1% penicilline-streptomycine, en 6 mg / ml-aminocapronzuur in DMEM. 50 ug / ml van ascorbinezuur en 2 ug / ml insuline in 25 uM HEPES direct moeten worden toegevoegd voordat het voeden. Monteer mandrel door het samenstellen van een teflon staafje, een teflon mouw, twee teflon ringen met een inkeping verwijderd voor injectie doeleinden, en twee rubberen O-ringen (zie Figuur 2a). Autoclaaf voor gebruik. Neem 6cc spuit behuizingen voor het buitenste deel van de matrijs en 3CC spuit darmen worden gebruikt als plunjers, en voor te bereiden door het afsnijden van de luer-lock uiteinden en de autoclaaf (zie Figuur 2a). 6. Casting fibrinegel bouwt – voorbereiding voor het creëren van fibrine gels (vlak voor het maken van de fibrine gel constructen) Oplossingen die in deze sectie: Pluronics oplossing Steriel filter de 5% Pluronics F-127 oplossing met een 0,2 um filter voor gebruik. Plaats spillen en spuit behuizingen in 5% Pluronics oplossing in een bekerglas van 1 liter in de motorkap. Laat de onderdelen onderdompelen in de Pluronics oplossing voor 2-3 uur in de motorkap om volledige coating garanderen. De Pluronics oplossing jassen van de spillen en voorkomt dat de fibrine gel van het naleven van de doornen. Na de 2-3 uur incubatie, giet de 5% Pluronics oplossing terug in de fles, plaats steriele doeken neer op het oppervlak van de kap en draag steriele handschoenen om de mallen te bouwen. Plaats de geconstrueerde doornen in de 6 cc spuit darmen, het gebruik van de 3CC spuit als een zuiger om een goede afdichting tussen de o-ringen en Teflon ringen te garanderen. 7. Casting fibrinegel bouwt via spuitgieten Oplossingen die in deze sectie: F-oplossing, T-oplossing, cel-oplossing. Om 1 mL van fibrine gel (3,3 mg / ml uiteindelijke concentratie fibrinogeen, 25 U / ml trombine uiteindelijke concentratie), maken F-oplossing in een conische buis, door toevoeging van 112 ul van de fibrinogeen voorraad 558 ul 20 mM HEPES buffer in 0,9% zoutoplossing. In een aparte conische buis, een T-oplossing door het toevoegen van 17 pi van het trombine voorraad, en 1,3 ul van 2 N Ca + +-oplossing tot 135 ul DMEM. Zie tabel 1. In een derde conische buis, bereiden een cel oplossing door te stoppen met draaien de cellen en resuspenderen de cellen in een volume, zodat de concentratie van de cel is 29,4 miljoen cellen / ml of 6 keer de concentratie van de gewenste uiteindelijke concentratie van cellen in het construct Wanneer u klaar bent om de fibrine gel construct, prep een 1 ml spuit met een 18G 1 ½ cm lange naald uit te brengen. Hebben een 21G 1 inch naald klaar ook. De fibrine oplossing is gemaakt op een 04:01:01 verhouding van F-oplossing: T oplossing: cel-oplossing. Om een ml gel, voeg 667 ul F-oplossing in een schone centrifugebuis van 50 ml, gevolgd door 167 pi van cel-oplossing, en tot slot voeg 167 ul van T-oplossing. Pipet om samen te mengen oplossing en let niet te bellen te introduceren. Zodra oplossingen worden gemengd, is de reactie gestart en de injectie van de constructies moet onmiddellijk worden gedaan. Neem de vooraf bereide spuit met de 18G naald en het opstellen van fibrine-oplossing. Zorg ervoor dat u de spuit om luchtbellen te voorkomen dat in de naald te keren. Vervang de 18G naald met een 21G naald. Tik zachtjes tegen spuit te dwingen uit luchtbellen. Plaats spuit in de mal tussen de stop en de behuizing naar aanleiding van de groef in de teflon O-ring en het injecteren van de oplossing in de mal. Kantel de mal met de groef op de top naar volledige vulling te verzekeren. Verwijder de spuit en ga verder met de resterende schimmels te vullen. Genoeg gel oplossing kan worden gecreëerd om verschillende vormen te vullen op hetzelfde moment. Echter, omdat de oplossing gels snel, is het meestal een goed idee om het aantal van constructen geïnjecteerd op een gegeven moment tot 6 te beperken. Wikkel de mallen in Parafilm in groepen van drie en plaats in de couveuse of oven op 37 ° C. Laat de gels tot broeden in de mallen voor 20 minuten, zodat de gel tijd om te polymeriseren. Vul elke cultuur pot (Nalgene straight-side pot) met 21 ml van het myocard te construeren medium per bouwen. Gebruik de steriele 3 cc spuit behuizing als een zuiger om de doorn kracht met de construct in een grote petrischaal met DMEM. Plaats dan het construct in het monster pot. Elke 16 oz pot kan houden tot en met 6 constructen, terwijl elke 4 oz pot kunnen houden 2. Schroef de doppen op de potten en breng ze naar de couveuse. Binnen in de incubator, draait u de doppen op de potten te zorgen voor gasuitwisseling. Na 24 uur, neem een steriel tandheelkundige kiezen en druk op de weg te construeren van de witte teflon O-ringen op de uiteinden van de ring mal om een uniforme lijn van de constructie zorgen (zie figuur 2 in representatieve resultaten). 8. Analysetechnieken (na 2 weken in de cultuur) – contractie kracht testen Oplossingen die in deze sectie: DMEM, myocard bouwen media. Klem de alligator clips aan de leiding uit de stimulator aan de draden van de elektroden in het bad. Zet de data-acquisitie raad van bestuur, puls generator, en kracht transducer. De kracht transducer moet worden overgeschakeld naar de 5 gram instelling en op nul gezet. Open een eigen LabView programma dat wordt weergegeven en slaat de gegevens van de krachtopnemer. Maak een nieuwe, lege tekstbestand in de data map voor elk monster. Plaats DMEM in de 37 ° C waterbad en laat de tijd voor haar om op te warmen voor het testen van de constructen. Eenmaal opgewarmd, plaats 37 ° C DMEM in het medium bad van de kracht meetsysteem (zie figuur 3A). Verwijder het construct van het monster pot door zachtjes te schuiven het construct ring van Teflon te ondersteunen met een pincet en plaats de bouw van via het vaste metalen post in de kracht meetsysteem medium bad. Geen grip het construct met het pincet! In plaats daarvan gebruikt de pincet te duwen en til de off constructie van ondersteuning van de spil. Plaats het andere uiteinde van de constructie boven de transducer arm en draai totdat de transducer leest 0.50V, (ongeveer 1,0 gram kracht of 10 milliNewtons van spanning) Selecteer de tekst-bestand voor de contractie kracht gegevens worden opgeslagen in. Op de cardiale stimulator (Model # S88X, Gras Technologies), stelt u de puls spanning naar 20V (8 V / cm), 6ms duur, en een tarief van 1 Hz. Start de elektrische pacing door op de "output on / off" knop Start de opname tot de golfvorm wordt regelmatig. Verwijder voorzichtig het construct van de kracht meetsysteem medium bad en weer plaats deze in kweekmedium. Verwijder vervolgens de DMEM van de kracht meetsysteem medium bad en te vervangen door frisse, warme DMEM tot Addit analyserenional monsters. Snijd de constructie en rol het zo dat u de lengte en breedte van het construct te meten Snijd het construct in secties te worden gebruikt voor verdere analyse metingen inclusief haalbaarheid, histologie, of western blot metingen. 9. Analysetechnieken (na 2 weken in de cultuur) – Live-Dead test voor de levensvatbaarheid (met Invitrogen Live / Dead Assay) 14: Oplossingen die in deze sectie: EthD-een voorraad-oplossing, calceïne AM voorraad oplossing PBS Spoel monsters met 3x 5 minuten wassen in PBS. Voeg 20 ul van 2 mM EthD-een stockoplossing aan 10 ml steriele PBS en vortex een grondige menging te verzekeren. Voeg 5 ul van 4 mM calceïne voorraad stolution uur tot EthD-1-oplossing. Nogmaals, om te vortex grondig te mengen. Voeg genoeg volume van de bovenstaande oplossing om het construct te dekken. Incubeer bedekt (om te voorkomen fotobleken van de kleurstoffen) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de kleurstoffen en te vervangen door warm PBS. Waarnemen en beelden opnemen met een fluorescentiemicroscoop. Calceïne wordt opgewekt door 494 nm licht en stoot 517 nm licht, terwijl ethidium homodimeer-1 is door 528 nm licht en stoot 617 nm licht. Zie afbeelding 4 voor de steekproefresultaten. 10. Analysetechnieken (na 2 weken in de cultuur) – immuunhistochemie voor belangrijke myocyte eiwitten: Oplossingen die in deze sectie: PBS, 4% paraformadehyde in PBS, 5% ezel serum in PBS, antilichamen in PBS, 0,1 ng / mL Hoechst 33258 in PBS. Spoel monsters met 3x 5 minuten wassen in PBS. Fix met 4% paraformaldehyde in PBS-oplossing, gedurende 2-3 uur bij 4 ° C Spoel monsters met 3x 5 minuten wassen in PBS. Het monster kan nu worden ingebed, coupes en gekleurd volgens het protocol van de keuze. Het resterende deel van dit protocol omvat hele construeren kleuring voor beeldvorming met confocale microscopie. Merk op dat de incubatietijd langer zijn dan die voor deel-weefsel als er behoefte is aan meer tijd voor de antilichamen worden te diffunderen in het construct. Daarnaast worden alle resterende stappen uitgevoerd bij kamertemperatuur. Voeg 0,1% Triton-X in PBS om de monsters gedurende 30 minuten om de celmembranen permeabilize. Spoel de monsters met 3x 10 minuten wasbeurten in PBS. Voeg 5% ezel serum in PBS om de monsters voor 1 ½ uur op een niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam blok aan de monsters. Voeg connexine 43 (1:50 verdunning) en myosine zware keten (1:100 verdunning) primaire antilichamen in PBS om de monsters gedurende 3 uur. Om zowel eiwitten label achtereenvolgens moet u ervoor zorgen dat de primaire antilichamen zijn uit verschillende hosts (dat wil zeggen konijn en muis). Spoel de monsters met 3x 10 minuten wasbeurten in PBS. Voeg de juiste fluorescent gelabelde secundaire antilichamen in PBS gedurende 3 uur. Spoel de monsters met 3x 10 minuten wasbeurten in PBS Net voor de beeldvorming van de monsters op de confocale microscoop, voeg 0,1 ng / ml Hoechst 33258 in PBS gedurende 15 minuten. Spoel de monsters met 3x 10 minuten wasbeurten in PBS. Analyseer de monsters expressie van MHC en Cx43 door beeldvorming van de cellen met een confocale microscoop (zie figuur 4 bijvoorbeeld resultaat). 11. Representatieve resultaten / uitkomsten: De cardiomyocyt fibrine construct omvat in eerste instantie de gehele breedte van de mal (Figuur 2B). Er geen luchtbellen moeten bestaan in de constructie en het moet uniforme uitstraling over de gehele lengte. Na twee weken van het kweken, het construct contract tot ongeveer een kwart van de oorspronkelijke breedte (figuur 2C). Wanneer het construct wordt elektrisch tempo in onze op maat contractie kracht apparaat (figuur 3A), kunnen twitch kracht gegevens worden gegenereerd, zoals aangegeven in figuur 3B. De golfvorm kan apart worden geanalyseerd in MATLAB (MathWorks) om de kracht, de snelheid van contractie, en de snelheid van ontspanning te bepalen. Twitch krachten van ongeveer 1,3 mN verwacht 6. Levensvatbaarheid van de cellen van het construct is afhankelijk van de diepte van het construct, als gevolg van de verspreiding beperkingen van zuurstof in het construct. Op het oppervlak van het construct, Figuur 4A, is hoog levensvatbaarheid van de cellen waargenomen. Met confocale microscopie, figuur 4B, is de lijn structuur van het construct waargenomen als gevolg van de myosine zware keten, MHC, is belangrijk voor de krimp, weergegeven in het rood. Connexine 43, in het groen weergegeven, is nodig voor cellulaire koppeling tussen myocyten. Figuur 1: Overzicht van de inkapseling proces Figuur 2: A) gescheiden en gecombineerde matrijsdelen voor het creëren van fibrine gels. Weerm van links naar rechts: twee Teflon ringen, twee siliconen o-ringen, een Teflon staaf, een teflon buis, een voltooide doorn, de buitenste behuizing voor de doorn, en de zuiger). B) onmiddellijk Construct op mal na het uitwerpen van de buitenkabel (dag 0). C) Gecompacteerde bouwen op schimmel (rode pijl), na 13 dagen van cultuur. Figuur 3: A) Custom krimp kracht meetsysteem voor het opnemen van twitch kracht. Een krachtopnemer met een post maatregelen de contractie kracht en uitgangen van de resultaten in een computer. Een bad met twee koolstof elektroden met draden aangesloten op een elektrische stimulator die passen het construct. De twee palen houden de constructie op zijn plaats. B) Voorbeeld twitch kracht waveform data gegenereerd met elektrische stimulatie bij 0,5 Hz. Figuur 4: A) Live / Dead analyse van bouwen, dag 13 (schaal bar = 400 pm). Groen staat voor de levende cellen en rood staat voor de dode cellen. B) Confocale Afbeelding van myosine zware keten (rood), connexine 43 (groen) en Hoescht nucleaire vlek (blauw) (schaal bar = 10 urn). F-oplossing T-oplossing Cel Solution Fibrinogeen 112 ul Trombine 17 pl Cellen in DMEM 170 ul HEPES 558μl Ca + + 1,3 pl DMEM 152 ul Totaal 670 ul Totaal 170 ul Totaal 170 ul Tabel 1. Fibrine gel oplossingen, hoeveelheden voor 1 ml gel. Let op: Fibrinogeen = 33 mg / ml Fibrinogeen in 20 mM HEPES gebufferd Saline HEPES = 20 mM HEPES gebufferde zoutoplossing Trombine = 25 U / mL oplossing in 0,81% NaCl-oplossing Ca + + = 2 N calciumchloride-oplossing