Summary

Toepassing van een muis geligateerd Peyer's Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

Published: December 17, 2011
doi:

Summary

M-cellen in een gespecialiseerde follikel geassocieerd epitheel die plaques van Peyer spelen een belangrijke rol voor de mucosale immunosurveillance in de darm-geassocieerd lymfoïd weefsel. Hier hebben we beschreven evaluatiemethode voor bacteriële transcytose door M-cellen<em> In vivo</em>. Deze methode biedt een methode om de M-cel functie te begrijpen in het immuunsysteem.

Abstract

De binnenkant van onze darmen wordt bewoond met een enorm aantal van de commensale bacteriën. De mucosale oppervlak van het maag-darmkanaal is continu blootgesteld aan hen en af ​​en toe aan pathogenen. De darm-geassocieerd lymfeweefsel (GALT) spelen een belangrijke rol voor de inductie van de mucosale immuunrespons op deze microben 1, 2. Tot inleiding van de mucosale immuunrespons, moet de mucosale antigenen worden vervoerd van de darm lumen over de epitheliale barrière in georganiseerde lymfoïde follikels zoals de plaques van Peyer. Dit antigeen transcytose wordt gemedieerd door gespecialiseerde epitheliale cellen M 3, 4. M-cellen zijn atypische epitheelcellen die actief fagocyteren macromoleculen en microben. In tegenstelling tot dendritische cellen (DC's) en macrofagen, die zich richten op antigenen te lysosomen voor degradatie, M cellen voornamelijk transcytose de geïnternaliseerde antigenen. Deze krachtige macromoleculaire transcytose door M cellen levert antigeen naar de onderliggende organisatie lymfoïde follikels eend wordt verondersteld essentieel te zijn voor het initiëren antigeen-specifieke mucosale immuunrespons. Echter, de moleculaire mechanismen ter bevordering van dit antigeen opname door M-cellen zijn grotendeels onbekend. We hebben eerder gemeld dat glycoproteïne 2 (GP2), in het bijzonder uitgedrukt op de apicale plasmamembraan van de M-cellen onder de enterocyten, dient als een transcytotic receptor voor een subset van commensale en pathogene enterobacteriën, waaronder Escherichia coli pt Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium ), door het herkennen FimH, een component van type I pili op het bacteriële buitenste membraan 5. Hier presenteren we een methode voor de toepassing van de pleister een muis Peyer's intestinale loop-test voor bacteriële opname te evalueren door M-cellen. Deze methode is een verbeterde versie van de muis intestinale loop test eerder beschreven 6, 7. De verbeterde punten zijn als volgt: 1. Isofluraan werd gebruikt als een anestheticum. 2. Ongeveer 1 cm geligeerde darm-lus inclusiefING Peyer's patch werd opgericht. 3. Bacteriën door M cellen genomen werden fluorescent gelabeld door fluorescentie etikettering reagens of door overexpressie fluorescerend eiwit zoals groen fluorescerend eiwit (GFP). 4. M-cellen in de follikel-geassocieerde epitheel die Peyer's patch werden gedetecteerd door middel van volledige mount immunostainig met anti GP2 antilichaam. 5. Fluorescerende bacteriën transcytose door M-cellen werden waargenomen door confocale microscopische analyse. De muis Peyer's patch intestinale loop-test zou kunnen leveren is het antwoord wat voor soort commensale of pathogene bacteriën transcytosed door M-cellen, en kan ons naar het moleculaire mechanisme van hoe mucosale immuunsysteem te stimuleren door middel van M cellen te begrijpen leiden.

Protocol

1. Voorbereiding van de bacteriële cellen Streak glycerol gevulde fluorescerende bacteriën (zoals GFP uiten van S. Typhimurium) op LB-agar een plaat met 100 ug / ml ampicilline. Cultuur een enkele kolonie van LB agar 's nachts in 2 ml van de nieuwe LB-medium. Voeg 0,5 ml van de bacteriecultuur tot 4,5 ml van de nieuwe LB medium en incubeer tot de optische dichtheid van 1.0 bij 600 nm is bereikt. Oogst bacteriële cellen door centrifugeren (3000 xg, 5 min, 4 ° C). …

Discussion

De incubatietijd van de patch afgebonden Peyer met bacteriële suspensie wordt meestal gedurende 1 uur om de bacteriële opname te observeren in de M-cellen. In het geval van 4 uur incubatie worden de bacteriën vaak gedetecteerd in de T cel zone van de plaques van Peyer. Omdat de verdampte isofluraan inhalatie-anesthesie kon houden muizen stabiel, de incubatietijd van de patch afgebonden Peyer met bacteriesuspensie is uitbreidbaar naar de bacteriën die verhuizen naar T-cel-zone in patch Peyer te observeren. Het …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen graag alle EIB-leden bedanken voor het ontwikkelen van deze techniek. Dit onderzoek werd mede ondersteund door Grant-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek op prioritaire gebieden "Membrane Traffic" (HO), en de "Matrix van infectieuze Phenomena" (KH), Young Scientists (SF en KH), en Wetenschappelijk Onderzoek (HO ), en Wetenschappelijk Onderzoek over innovatieve Areas "Intracellulaire Logistics" (HO), van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie van Japan.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
LB Agar Ampicillin-
100
SIGMA L5667  
Cy3 mono-Reactive
Dye Pack
GE Healthcare PA23001  
Alexa Fluor 350
carboxylic acid,
succinimidyl ester
Invitrogen A10168  
Inhalation anesthesia
apparatus
Shinano Seisakusho SN-487  
Fixation and
Permeabilization
Solution
BD 554722  
Anti mouse
Glycoprotein 2
antibody
MBL D278-3 200-fold dilution (5μg/ml)
Goat Anti-Rat IgG,
F(ab’)2 fragment
specific
Jackson
ImmunoResearch
112-505-006 200-fold dilution (20μg/ml)
Alexa Fluor 633
Phalloidin
Molecular Probes A22284 50-fold dilution
Confocal laser
scanning microscope
Leica Microsystems DMIRE2  
DeltaVision
Restoration
deconvolution
microscope
Applied Precision DeltaVision Core  

Referências

  1. Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
  2. Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Science. 328, 1705-1709 (2010).
  3. Owen, R. L., Jones, A. L. Epithelial cell specialization within human Peyer’s patches: an ultrastructural study of intestinal lymphoid follicles. Gastroenterology. 66, 189-203 (1974).
  4. Neutra, M. R., Mantis, N. J., Kraehenbuhl, J. P. Collaboration of epithelial cells with organized mucosal lymphoid tissues. Nat. Immunol. 2, 1004-1009 (2001).
  5. Hase, K. Uptake through glycoprotein 2 of FimH(+) bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, 226-230 (2009).
  6. Punyashthiti, K., Finkelstein, R. A. Enteropathogenicity of Escherichia coli. I. Evaluation of mouse intestinal loops. Infect. Immun. 4, 473-478 (1971).
  7. Owen, R. L., Pierce, N. F., Apple, R. T., Cray, W. C. M cell transport of Vibrio cholerae from the intestinal lumen into Peyer’s patches: a mechanism for antigen sampling and for microbial transepithelial migration. J. Infect. Dis. 153, 1108-1118 (1986).
  8. Owen, R. L. M cells–entryways of opportunity for enteropathogens. J. Exp. Med. 180, 7-9 (1994).
  9. Clark, M. A., Hirst, B. H., Jepson, M. A. M-cell surface beta1 integrin expression and invasin-mediated targeting of Yersinia pseudotuberculosis to mouse Peyer’s patch M cells. Infect. Immun. 66, 1237-1243 (1998).
  10. Jensen, V. B., Harty, J. T., Jones, B. D. Interactions of the invasive pathogens Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes, and Shigella flexneri with M cells and murine Peyer’s patches. Infect. Immun. 66, 3758-3766 (1998).
  11. Nagai, S. Role of Peyer’s patches in the induction of Helicobacter pylori-induced gastritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 8971-8976 (2007).

Play Video

Citar este artigo
Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. J. Vis. Exp. (58), e3225, doi:10.3791/3225 (2011).

View Video