Summary

Monitoreo células inmunes Tráfico Varillas fluorescente priones horas de la infección intraperitoneal

Published: November 19, 2010
doi:

Summary

A continuación se describe un ensayo de novela de Vigilancia de la aceptación de priones y el tráfico por las células inmunes inmediatamente después de la inoculación intraperitoneal de purificación y el etiquetado fluorescente barras de agregados de priones a partir de material cerebral infectado entonces el seguimiento de su consumo y el movimiento del punto de inyección y la caracterización de las células mediadoras de estos eventos.

Abstract

Presencia de una forma anormal de una proteína priónica codificada por el hospedador (PrP), que es resistente a la proteasa, patológicos e infecciosos caracteriza a las enfermedades por priones, tales como caquexia crónica (CWD) de los cérvidos y la tembladera en las ovejas. La hipótesis del prión afirma que esta conformación anormal constituye la mayor parte o la totalidad de los priones infecciosos. El papel del sistema inmunológico en los primeros eventos en la patogénesis del prión periférico ha sido demostrado de manera convincente de la caquexia crónica y 1-3 scrapie. Transgénicos y los estudios farmacológicos en ratones revelaron un papel importante del sistema del complemento en la retención y la reproducción de los priones poco después de la infección por 4-6. In vitro e de vivo también han observado la retención de priones por las células dendríticas 70-10, aunque su papel en el tráfico sigue siendo claro 11-16. Los macrófagos también han sido implicados en la patogénesis del prión temprano, pero estos estudios se han centrado en los acontecimientos que ocurren semanas después de la infección 3,11,17. Estos estudios previos también sufren el problema de diferenciar entre endógeno PrP C y los priones infecciosos. Aquí se describe un método semicuantitativo, imparcial para evaluar la absorción de priones y el tráfico del sitio de la inoculación de las células inmunes reclutados en ella. Barras de agregados de priones fueron purificados de homogenato de cerebro infectado por solubilización de detergente no agregados y proteínas ultracentrifugación a través de un colchón de sacarosa. Electroforesis en gel de poliacrilamida, teñidos de azul Coomassie y el oeste de la recuperación de las barras de Blot confirmó priones altamente enriquecido en la fracción de gránulos. Barras de priones por vía intraperitoneal fueron marcados con fluorocromos luego inyectadas en ratones. Dos horas más tarde, las células inmunes del líquido lavado peritoneal, el bazo y los ganglios linfáticos del mediastino y mesentéricos se analizaron para la retención de priones vara y subconjuntos de células identificadas mediante citometría de flujo multicolor con marcadores de monocitos, neutrófilos, células dendríticas, macrófagos y células B y T. Este ensayo permite el control directo por primera vez de las células inmunes y la adquisición de los priones pt el tráfico vivo en cuestión de horas después de la infección. Este ensayo también se diferencia claramente los priones infecciosos, agregados de PrP normalmente se expresa en las células huésped, que puede ser difícil y llevar a problemas de interpretación de los datos en los sistemas de ensayo de otros. Este protocolo se puede adaptar a las rutas de inoculación otros (oral, intranervous intravenosa y subcutánea, por ejemplo) y los antígenos (cuentas conjugado, los patógenos bacterianos, virales y parasitarias y las proteínas, el huevo), así.

Protocol

1. Purificación y Etiquetado de Prion Rods Este protocolo es una adaptación de otra publicada anteriormente 18 Homogeneizar 100 gramos de priones infectados con el tejido cerebral en 900 ml de hielo frío buffer de homogeneización (HB, 1X PBS que contenía 320 mM de sacarosa, NaCl 150 mM EDTA y 4 mM) 1 min a máxima velocidad en un comercial de la licuadora, luego 2 minutos en hielo. Repita tres veces. Centrífuga homogeneizado durante 10 minutos a 30…

Discussion

Aquí se demuestra un protocolo para el etiquetado y el seguimiento de los priones en vivo que facilita enormemente el control los primeros eventos en la infección por priones periféricos. Este protocolo mejora en gran medida en anteriores intentos de control de la utilización de priones in vitro e de vivo 9 3,12 por pre-etiquetado inóculo priones altamente enriquecido de forma inequívoca la diferencian de PrP C endógena. Debido a que los priones infecciosos y

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a Steve Hansen McBryant y Jeff para ayudar con la ultracentrifugación y Kiser Patti para ayudar con el manejo del ratón. El Instituto Nacional de Enfermedades Neurológicas e Ictus de los Institutos Nacionales de Salud, otorgar 5R01NS056379-02 financiado este trabajo.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
CWD-infected elk brain   Private elk farm in Colorado   Use any non-human prion-infected brain
Blender   Oster 6694-015 Use any commercial blender
Centrifuge   Sorvall SS34 rotor Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes
Ultracentrifuge   Beckman 50.2 Ti rotor Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes
Bradford Reagent   Sigma-Aldrich B6916  
Complete mini protease inhibitor cocktail   Roche 11 836 170 001  
Sonicator   Misonix MP4000X Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power
DyLight antibody Labeling kit   Thermo Scientific 53050  
microcentrifuge   Eppendorf 55430R Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g
centrifugal filter columns   Millipore Microcon YM-100 Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff
8-40 week-old FVB mice   Charles River 207 Use any inbred mouse strain
1 μm red fluorescent beads   Phosphorex 2307 Use any fluorescent bead ≤ 10 μm
RPMI 1640 medium   Invitrogen 11875-093  
40 μm cell strainer   Falcon 352340  
fluorescent antibodies   BD pharmingen Various Use any fluorescent antibody appropriate for your application.
flow cytometer   Dakocytomation CyanADP Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection

Referências

  1. Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
  2. Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
  3. Sigurdson, C. J. PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer. J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).
  4. Klein, M. A. Complement facilitates early prion pathogenesis. Nat Med. 7, 488-488 (2001).
  5. Mabbott, N. A. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie. Nat Med. 7, 485-485 (2001).
  6. Zabel, M. D. Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis. J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).
  7. Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection. J Virol. 82, 8933-8933 (2008).
  8. Dorban, G. Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer’s patches’ dendritic cells. Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).
  9. Flores-Langarica, A. Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells. J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).
  10. Huang, F. P., MacPherson, G. G. Dendritic cells and oral transmission of prion diseases. Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).
  11. Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine. Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).
  12. Aucouturier, P. Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie. J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).
  13. Huang, F. P. Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut. J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).
  14. Jeffrey, M. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep. J Pathol. 209, 4-4 (2006).
  15. Raymond, C. R., Mabbott, N. A. Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems. J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).
  16. Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure. Immunology. 116, 122-122 (2005).
  17. Gilch, S. CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells. FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).
  18. Safar, J. Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).
  19. Büeler, H. R. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73, 1339-1339 (1993).

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Citar este artigo
Johnson, T. E., Michel, B. A., Meyerett, C., Duffy, A., Avery, A., Dow, S., Zabel, M. D. Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection. J. Vis. Exp. (45), e2349, doi:10.3791/2349 (2010).

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