Summary

Мониторинг Иммунные клетки торговли Флуоресцентный Прион стержни часов после внутрибрюшинного инфекции

Published: November 19, 2010
doi:

Summary

Здесь мы опишем новый тест для мониторинга поглощения прионов и торговли иммунными клетками сразу же после внутрибрюшинного прививки, очищая и флуоресцентно маркировки агрегированных стержней прионов из инфицированного материала мозг, то контроль за их поглощения и движение от места инъекции и характеризующие клетки посредническую этих событий.

Abstract

Наличие ненормальной форме хост в кодировке прионных белков (PrPC), которые устойчивы протеазы, патологических и инфекционных характеризует прионных заболеваний, таких как хроническая изнуряющая болезнь (УХО) в cervids и скрепи у овец. Прионы гипотеза утверждает, что это ненормальное конформера составляет большую часть или все инфекционных прионов. Роль иммунной системы в ранние события в периферийных патогенеза прионных было убедительно продемонстрировано УХО и скрепи 1-3. Трансгенные и фармакологические исследования на мышах показали важную роль системы комплемента в сохранении и репликация прионов в ранние сроки после инфекции 4-6. В пробирке и в естественных исследованиях также наблюдается прионных удержания дендритные клетки 7-10, хотя их роль в торговле остается неясно 11-16. Макрофаги подобным же образом были замешаны в начале патогенеза прионных, но эти исследования были сосредоточены на событиях, происходящих недель после заражения 3,11,17. Эти предыдущие исследования, также страдают от проблемы различия между эндогенными PrP C и инфекционные прионы. Здесь мы опишем полуколичественного, непредвзятый подход для оценки поглощения прионов и торговли от прививки сайт иммунными клетками работу там. Агрегированные стержней прионов были очищены от инфицированных гомогената мозга моющее средство солюбилизации неагрегированном белков и ультрацентрифугирования через сахарозы подушке. Полиакриламидном геле, Кумасси синим окрашиванием и западных промокательной подтвердил восстановления обогащенного прионных стержней в гранулированной фракции. Прионы стержни флуорохромом меченных затем вводили внутрибрюшинно мышам. Через два часа иммунных клеток из перитонеального лаважа жидкости, селезенки и средостения и брыжеечные лимфатические узлы были исследованы на прион удержания стержня и клеточных подмножеств, определенных многоцветной проточной цитометрии с использованием маркеров для моноцитов, нейтрофилов, дендритные клетки, макрофаги и В и Т-клеток. Этот анализ позволяет впервые прямой мониторинг иммунных клеток приобретения и торговли прионов в естественных условиях в течение нескольких часов после заражения. Этот анализ также четко различает инфекционных, агрегированные прионы из PrPC обычно выражается на клетки-хозяина, который может быть сложным и привести к интерпретации данных проблем в других системах анализа. Этот протокол может быть адаптирован для других маршрутов прививки (устный, внутривенно, intranervous и подкожно, например) и антигенов (сопряженных бусы, бактериальных, вирусных и паразитарных патогенов и белки, яйцо), а также.

Protocol

1. Очищающий и маркировки Прион стержни Этот протокол адаптирован от одного ранее опубликованной 18 Однородный 100 граммов прион-инфицированные ткани головного мозга в 900 мл ледяной гомогенизации буфера (HB, 1X PBS содержащей 320 мМ сахарозы, 150 мМ NaCl и 4 мм ЭДТА) 1 м…

Discussion

Здесь показано, протокол для маркировки и отслеживания прионов в естественных условиях, что значительно облегчает мониторинг ранних событий в периферической инфекции прион. Этот протокол значительно повышает на прошлых попытках мониторинга поглощения прионов в пробирке <su…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Стива McBryant и Джефф Хансен за помощь в ультрацентрифугирования и Патти Кайзер за помощью мыши обработки. Национального института неврологических заболеваний и инсульта в Национальном институте здоровья, грант 5R01NS056379-02 финансируемой этой работы.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
CWD-infected elk brain   Private elk farm in Colorado   Use any non-human prion-infected brain
Blender   Oster 6694-015 Use any commercial blender
Centrifuge   Sorvall SS34 rotor Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes
Ultracentrifuge   Beckman 50.2 Ti rotor Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes
Bradford Reagent   Sigma-Aldrich B6916  
Complete mini protease inhibitor cocktail   Roche 11 836 170 001  
Sonicator   Misonix MP4000X Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power
DyLight antibody Labeling kit   Thermo Scientific 53050  
microcentrifuge   Eppendorf 55430R Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g
centrifugal filter columns   Millipore Microcon YM-100 Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff
8-40 week-old FVB mice   Charles River 207 Use any inbred mouse strain
1 μm red fluorescent beads   Phosphorex 2307 Use any fluorescent bead ≤ 10 μm
RPMI 1640 medium   Invitrogen 11875-093  
40 μm cell strainer   Falcon 352340  
fluorescent antibodies   BD pharmingen Various Use any fluorescent antibody appropriate for your application.
flow cytometer   Dakocytomation CyanADP Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection

Referências

  1. Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
  2. Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
  3. Sigurdson, C. J. PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer. J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).
  4. Klein, M. A. Complement facilitates early prion pathogenesis. Nat Med. 7, 488-488 (2001).
  5. Mabbott, N. A. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie. Nat Med. 7, 485-485 (2001).
  6. Zabel, M. D. Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis. J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).
  7. Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection. J Virol. 82, 8933-8933 (2008).
  8. Dorban, G. Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer’s patches’ dendritic cells. Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).
  9. Flores-Langarica, A. Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells. J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).
  10. Huang, F. P., MacPherson, G. G. Dendritic cells and oral transmission of prion diseases. Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).
  11. Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine. Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).
  12. Aucouturier, P. Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie. J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).
  13. Huang, F. P. Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut. J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).
  14. Jeffrey, M. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep. J Pathol. 209, 4-4 (2006).
  15. Raymond, C. R., Mabbott, N. A. Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems. J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).
  16. Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure. Immunology. 116, 122-122 (2005).
  17. Gilch, S. CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells. FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).
  18. Safar, J. Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).
  19. Büeler, H. R. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73, 1339-1339 (1993).

Play Video

Citar este artigo
Johnson, T. E., Michel, B. A., Meyerett, C., Duffy, A., Avery, A., Dow, S., Zabel, M. D. Monitoring Immune Cells Trafficking Fluorescent Prion Rods Hours after Intraperitoneal Infection. J. Vis. Exp. (45), e2349, doi:10.3791/2349 (2010).

View Video