Summary

의 Organotypic 슬라이스 문화 GFP - 표현 주변 신경 가지의 실시간 이미징을위한 마우스 배아를

Published: March 29, 2011
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Summary

우리는 주변 신경 가지의 재배와 시간 경과 영상을위한 중간 회임 마우스 배아의 organotypic 조각을 준비하는 방법을 제시한다.

Abstract

다양한 목적을 위해, organotypic 조각으로 마우스 배아의 전의 생체내의 재배가 바람직합니다. 예를 들어, 우리는 모두 영화의 innervation에 가능성을 허용, 녹색 형광 단백질 (EGFP)의 향상된 버전이 독점적으로 개발 중심과 주변 신경계 하나의 뉴런에서 표현되는 유전자 변형 마우스 라인 (tauGFP)를 채택 forelimb가와 약리과 유전 기법이이 과정을 조작합니다. 이러한 슬라이스 문화의 성공적인 재배에서 가장 중요한 매개 변수는 조각을 준비하는 방법입니다. 다양한 방법의 광범위한 테스트 후, 우리가 vibratome들이 일상적으로 몇 일 동안 생존하고, 가장 중요한을 보여 문화에 따라서 그러한 배아를 슬라이스하는 최선의 장치는 것을 발견, 시대에 발전 특정 방식. 중반에 태동하고 배아의 경우, 이것은 척수와 지느러미 루트 신경의 주변과 골격 및 근육 조직의 적절한 판단에 자신의 목표에 척수 신경의 정상적인 파생물이 포함되어 있습니다.

슬라이스 준비 후 2 일을 위해 공부를 할 수있는 표준 조직 문화 인큐베이터에서 재배 400 마이크로 미터 조각 -이 작품에서 우리는 300로 (E) E10 E12에 배아 일 전체 배아를 처리하는 방법을 제시. 이 방법의 성공을 위해 중요 각각의 아가로 오스 – 임베디드의 배아를 슬라이스하는 vibratome의 사용입니다. 이 인터페이스 문화 기술에서 발생하는 중간의 작은 볼륨에 배치 Millicell 문화 막 삽입,시 조각의 재배옵니다. 7 배아의 평균 한 쓰레기는 정기적으로 인해 태아의 나이뿐만 아니라, 조각의 두께에 약간 차이가 최소 14 조각 (태아 당 forelimb 영역로부터 2-3 조각)을 생산하고 있습니다. 교양 조각의 80 % 정도는 culturing 기간 2 througout 측정할 수 신경 가지를 보여줍니다. tauGFP 마우스 라인을 사용하는 대표적인 결과가 증명하고 있습니다.

Protocol

1 부 : 깔끔히 및 culturing 준비. 매체 (DMEM, 25 % 1X HBSS, 25 % 태아 소 혈청, 0.5 % 포도당, 1 ㎜의 글루타민, 2.5 MM HEPES, 산도 7.3) 및 3 – cm Millicell – CM 0.4 – μm의 문화를 깔끔히 10 – cm 조직 문화 플레이트 준비 멤브레인 삽입하고 37 인큐베이터에 보관 ° C와 5% CO 2. 그것이 약 37 숙박 있도록 전자렌지에 PBS에 4% 낮은 용융 점 아가로 오스를 가열하고 가열 접시에 보관 ° C. PBS (140 MM…

Discussion

중간 회임 마우스 배아의 배아 슬라이스 문화 (E10 – E12)를 준비하는 방법의 광범위한 비교에서, 우리는 vibratome가 문제없이 문화의 전반적인 생존과 재현성 모두와 관련하여 가장 신뢰할 수있는 결과를 생산하는 것을 관찰했습니다 신경 가지 패턴. 반대로, 조각이 맥일웨인 조직 헬기 3 완전히 inviable 것으로 판명을 사용하여 준비 하였다. 우리는 원래 배아의 전체 쓰레기가 동시에 400 μm의 …

Acknowledgements

저자는 마우스 배아 5시 슬라이스 문화를 수행할 수있는 아이디어의 원본 소스를 인정합니다. 우리는 촬영하는 동안 우리의 심부름꾼 역할에 대한 관대한 과학 지원과 안나 Degen에 대한 요아킴 커쉬을 인정하고 싶습니다. 그리고 하이 델베르크 (우수 클러스터 셀룰러 네트워크)의 대학이 작품은 독일 연구 재단 (Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9 도이치 Forschungsgemeinschaft)에 의해 재정 지원되었다.

Materials

Material Name Tipo Company Catalogue Number Comment
HBSS 10x   GIBCO 14180  
Dissection tools   FST various  
L.M.P. agarose   Invitrogen 15517-022  
Whatmann paper   Whatman Int. 3030917  
Shortened firepolished pipettes        
DMEM   GIBCO 41966  
FBS   GIBCO 10270-106  
Pen Strep   GIBCO 15140  
L-glutamine 100x   GIBCO 25030  
Vibratome   Microm International GmbH HM 650 V  
Fluorescent microscope   Olympus BX61WI  
analySIS   Soft Imaging System    
Millicell-CM inserts   Millipore PICMORG 50  
10 cm culture plates   Greiner Bio-One 633171  
LOCTITE 406   Henkel 142580  
Razor blades   Thermo Fisher none  
Dissecting microscope   Nikon SMZ800  
HEPES   Roth 9105.2  
Glucose   Sigma G7021  
x4 objective   Olympus PL series  
x10 objective   Olympus UPLFL –PH series  
Filter   Olympus U-MNIBA2  
CCD camera   Soft Imaging System SIS F-View II  
Equipment for heated chamber   Leica CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171  

Referências

  1. Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
  2. Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
  3. Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
  4. Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
  5. Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).

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Citar este artigo
Brachmann, I., Tucker, K. L. Organotypic Slice Culture of GFP-expressing Mouse Embryos for Real-time Imaging of Peripheral Nerve Outgrowth. J. Vis. Exp. (49), e2309, doi:10.3791/2309 (2011).

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