Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade
Summary
Biz periferik sinir akıbet ekimi ve zaman atlamalı görüntüleme için gebeliğin orta fare embriyo Organotipik dilim hazırlamak için bir yöntem mevcut.
Abstract
Birçok amaç için, fare embriyoları ex vivo Organotipik dilimleri olarak ekimi arzu edilir. Örneğin, biz, hem filmin innervasyon imkanı sağlayan, yeşil flüoresan protein (EGFP) geliştirilmiş bir versiyonu sadece gelişmekte olan santral ve periferal sinir sistemi 1 bütün nöronlar ifade edildiği bir transgenik fare hattı (tauGFP) istihdam farmakolojik ve genetik teknikleri ile 2 ön ayakları ve bu süreci yönetmek için. Böyle bir dilim kültürlerin başarılı yetiştiriciliğinde en kritik parametre dilimleri tarafından hazırlanan bir yöntemdir. Çeşitli yöntemler geniş test ettikten sonra, bir vibratome, onlar, birkaç günlük bir süre içinde canlılığını ve en önemlisi gösteren bir kültür rutin Sonuç olarak bu tür embriyoların dilim mümkün olan en iyi cihaz olduğunu bulduk, bir yaş gelişir özel bir şekilde. Gebeliğin orta embriyolar için, bu, omurilik ve dorsal kök gangliyon, çevre ve iskelet ve kas dokusu uygun belirlenmesi hedeflerine spinal sinirlerin normal akıbet içerir.
400 mikrometre dilim dilim hazırlandıktan sonra iki gün için çalışılan bir standart doku kültürü inkübatör, tarım için – Bu çalışmada, 300 içine (E) E10 E12 embriyonik gün bütün embriyolar işlenmesi için bir yöntem mevcut. Bu yaklaşımın başarısı için kritik her agaroz gömülü embriyo dilim vibratome kullanılmasıdır. Bu bir arayüz kültür tekniği ile sonuçlanan orta küçük bir hacim üzerine yerleştirilen Millicell kültür membran ekler, üzerine dilim ekimi tarafından takip edilmektedir. 7 embriyoların ortalama bir çöp rutin nedeniyle embriyoların yaşın yanı sıra dilimlerin kalınlığı biraz değişir en az 14 dilim (2-3 dilim embriyo başına ön ayakları bölgenin), üretir. Kültürlü dilim yaklaşık% 80'i, tüm kültür süresi 2 boyunca ölçülen sinir akıbet göstermektedir. TauGFP fare satırını kullanarak Temsilcisi sonuçlar gösterilmiştir.
Protocol
Discussion
Gebeliğin orta fare embriyoları embriyonik dilim kültürleri (E10 – E12) hazırlamak için kapsamlı bir yöntem karşılaştırıldığında, biz bir vibratome soru kültürlerin genel uygulanabilirliği ve tekrarlanabilirliği hem açısından en güvenilir sonuçlar verdiğini gözlemledik sinir akıbet desenler. Buna karşılık, dilimler 3 tamamen inviable olduğunu kanıtladı McIlwain doku kıyıcı kullanılarak hazırlanmıştır. Biz aslında tüm embriyoların bir çöp eş zamanlı seri üretme…
Acknowledgements
Yazarlar fare embriyoları üzerine 5 dilim kültürü gerçekleştirmek için fikir için özgün kaynak kabul ediyorsunuz. Biz çekimler sırasında bizim Gofer olarak hareket etmek için cömert bilimsel destek ve Anna Degen Joachim Kirsch kabul etmek istiyorum. Heidelberg Üniversitesi (Mükemmellik Küme Hücresel Ağlar): Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı (Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9 Deutsche Forschungsgemeinschaft) tarafından finanse edildi.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HBSS 10x | GIBCO | 14180 | ||
| Dissection tools | FST | various | ||
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | ||
| Whatmann paper | Whatman Int. | 3030917 | ||
| Shortened firepolished pipettes | ||||
| DMEM | GIBCO | 41966 | ||
| FBS | GIBCO | 10270-106 | ||
| Pen Strep | GIBCO | 15140 | ||
| L-glutamine 100x | GIBCO | 25030 | ||
| Vibratome | Microm International GmbH | HM 650 V | ||
| Fluorescent microscope | Olympus | BX61WI | ||
| analySIS | Soft Imaging System | |||
| Millicell-CM inserts | Millipore | PICMORG 50 | ||
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | ||
| LOCTITE 406 | Henkel | 142580 | ||
| Razor blades | Thermo Fisher | none | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | ||
| HEPES | Roth | 9105.2 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| x4 objective | Olympus | PL series | ||
| x10 objective | Olympus | UPLFL –PH series | ||
| Filter | Olympus | U-MNIBA2 | ||
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | ||
| Equipment for heated chamber | Leica | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
Referências
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).
