Gonad Microinjection: שיטה של משלוח מורכב ישירות לתוך הנבט של C. אלגנס

Published: April 30, 2023

Abstract

מקור: Farboud, B. ואח ‘, עריכת גנום משופרת עם Cas9 ריבונוקלאופרוטאין בתאים מגוונים ואורגניזמים. ג’יי ויס אקספ. (2018). 

וידאו זה מתאר microinjection, שיטה נפוצה של יצירת זנים מהונדסים C. elegans.   בדוגמה, נראה microinjection המשמש להצגת קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין (RNP) לעריכת גנים של בסיסי CRISPR.

Protocol

הפרוטוקול הבא הוא קטע מתוך Farboud et al, עריכת גנום משופרת עם Cas9 ריבונוקלאופרוטאין בתאים ואורגניזמים מגוונים, J. Vis. Exp. (2018). 1. הרכבת RNP תכנן את הניסוי מבעוד מועד, ורכש מראש את כל רכיבי ה- RNA, ה- …

Representative Results

טבלה 1: בקרות חיוביות לניסויים ראשוניים בעריכת גנום. טבלה זו מציגה את המידע העיקרי הדרוש לביצוע ניסוי עריכת גנום בפעם הראשונה בכל אחד מהתאים והאורגניזמים המתוארים בפרוטוקול זה. ביצוע פרמטרים אלה עשוי להניב תוצאה מוצלחת שניתן…

Materials

Reagents/Materials
DNA oligonucleotides Integrated DNA Technologies IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs Synthego Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) New England Biosciences M0646T If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center OP-50 https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID World Precision Instruments 1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID  World Precision Instruments 1B200-6 
Cover glass; 24 × 50 mm Thermo Fisher Scientific 12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm Thermo Fisher Scientific 12-518-105K
Apex LE agarose Genesee Scientific 20-102
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich  H8898-100ML
pCFJ90 plasmid Addgene 19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)  World Precision Instruments T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)
9" pasteur pipettes
Nuclease-free water
Equipment
MZ75 Stereomicroscope Leica  Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope Zeiss Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) Sutter Instrument  FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) Warner Instruments PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator Narishige International MO-202U
Coarse manipulator Narishige International MMN-1
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956003
NG-agar

Play Video

Citar este artigo
Gonad Microinjection: A Method of Compound Delivery Directly into the Germline of C. elegans. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20168, doi: (2023).

View Video