Gonad Microinjection: Eine Methode der zusammengesetzten Lieferung direkt in die Keimbahn von C. elegans

Published: April 30, 2023

Abstract

Quelle: Farboud, B. et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms. J. Vis. (2018). 

Dieses Video beschreibt die Mikroinjektion, eine gängige Methode zur Schaffung transgener C. elegans-Stämme.   Im Beispiel sehen wir, wie Mikroinjektionverwendet wird, um einen Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex für die GENbearbeitung von CRISPR-Basen einzuführen.

Protocol

Das folgende Protokoll ist ein Auszug aus Farboud et al, Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms, J. Vis. Exp. (2018). 1. RNP-Baugruppe Entwerfen Sie das Experiment rechtzeitig und erwerben Sie alle RNA-, DNA- und Proteinkomponenten im Voraus. Versuchen Sie zunächst eine der in Tabelle …

Representative Results

Tabelle 1: Positive Kontrollen für vorläufige Genombearbeitungsexperimente. Diese Tabelle zeigt die wichtigsten Informationen, die für die Durchführung eines ersten Genombearbeitungsexperiments in jeder der in diesem Protokoll beschriebenen Zellen und Organismen erforderlich sind. Das Folgen dieser Parameter wird wahrscheinlich zu einem erfolgreichen Ergebnis führen, das verwendet werden kann, um das …

Materials

Reagents/Materials
DNA oligonucleotides Integrated DNA Technologies IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1
Guide RNAs Synthego Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) New England Biosciences M0646T If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option
OP50 Escherichia coli Caenorhabditis Genetics Center OP-50 https://cgc.umn.edu/
Nematode Growth Media agar in petri dishes See Stiernagle, T (ref. 59)
Standard borosilicate glass capillaries with filament:  4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID World Precision Instruments 1B100F-4
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID  World Precision Instruments 1B200-6 
Cover glass; 24 × 50 mm Thermo Fisher Scientific 12-544E
Cover glass; 22 × 22 mm Thermo Fisher Scientific 12-518-105K
Apex LE agarose Genesee Scientific 20-102
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich  H8898-100ML
pCFJ90 plasmid Addgene 19327
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm)  World Precision Instruments T2100F-4
Petri dishes (100 × 15 mm)
9" pasteur pipettes
Nuclease-free water
Equipment
MZ75 Stereomicroscope Leica  Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope Zeiss Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) Sutter Instrument  FG-P2000
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) Warner Instruments PLI-100A
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator Narishige International MO-202U
Coarse manipulator Narishige International MMN-1
Microloader pipette tips Eppendorf 5242956003
NG-agar

Play Video

Citar este artigo
Gonad Microinjection: A Method of Compound Delivery Directly into the Germline of C. elegans. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20168, doi: (2023).

View Video