Island Assay: Une méthode à haut débit pour évaluer le comportement locomoteur Drosophila

Ce protocole est un extrait d’Eidhof et coll.,High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).

1. Construction de la boîte d’analyse de l’île

1. Préparer un plateau fait d’un matériau robuste, comme le méthacrylate poly méthyle (PMMA), pour contenir une couche d’eau(c.-à-d. un bain). Assurez-vous que le matériau n’est pas blanc.
   REMARQUE: Des dimensions de 40 x 35 x 2,5 cm^{3 sont} recommandées (figure 1A).
2. Préparer une boîte (42 x 38 x 25 cm³⁾faite d’un matériau robuste et transparent, comme le PMMA, à placer autour du bain pour empêcher les mouches de s’échapper dans l’espace de laboratoire. Placez un trou (20 x 30 cm²⁾sur le côté latéral qui est assez grand pour que l’expérimentateur manipule facilement les flacons avec des mouches et les dépose sur l’île (figure 1A).
3. Préparez une plate-forme surélevée de 10 x 15 x 2,5 cm³ en dimension, faite d’un matériau imperméable (PMMA ou plastique) étanche.
   REMARQUE: Cette plate-forme est nécessaire pour avoir une surface blanche uniforme pour assurer un bon contraste pour l’analyse d’image. La taille n’est pas nécessairement fixe, mais elle devrait être suffisamment grande pour s’assurer que toutes les mouches atterrissent d’abord sur la plate-forme et ont la chance de marcher dessus (figure 1A).
4. Fixez la plate-forme en la collant dans le bain ou en plaçant des poids ou d’autres objets lourds à l’intérieur de la boîte de plate-forme pour empêcher les changements de position de la plate-forme pendant la session expérimentale/de tournage.

2. Exigences logicielles et installation

1. Installation d’un logiciel d’enregistrement d’images.
   1. Téléchargez un logiciel d’enregistrement d’images pour enregistrer la série d’images de l’île (voir la Table desmatériaux) et installez le logiciel sur un ordinateur.
      REMARQUE: Le logiciel d’enregistrement d’imagerie décrit dans ce protocole n’est pris en charge que par Windows. Une alternative pour les autres utilisateurs a été ajoutée à la Table des Matériaux.

3. Préparation des mouches à tester dans l’analyse de l’île

1. Recueillir des mouches par étapes pour chaque condition expérimentale sous anesthésie froide ou de dioxyde de carbone (CO_2),comme décrit précédemment (sur une période de 1 à 2 jours).
   1. Préparer un minimum de 3 flacons d’échantillon par condition expérimentale, chacun contenant environ 15 mouches mises en scène. N’utilisez que des mouches aux ailes intactes et d’âge et de sexe similaires.
      REMARQUE: Pour les expériences décrites ici, 5 flacons d’échantillon contenant 15 mouches mâles des génotypes w^-; Actin-Gal4/+ (contrôle) et w^-; Actin-Gal4/GD11950 (tefu RNAi) ont été recueillis le jour de l’éclosion, âgés de 4 jours, et ont été utilisés pour effectuer l’analyse de l’île. RNAi, souches de contrôle, et le conducteur Actin-gal4 ont été obtenus à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).
2. Laissez les mouches récupérer pour éviter les effets de l’anesthésie (au moins 1 jour lors de l’utilisation du CO₂₎avant de tester les mouches collectées dans l’analyse de l’île à l’âge d’intérêt.

4. Configuration expérimentale

REMARQUE: Voir la figure 1B.

1. Ajouter l’eau froide avec une petite quantité de savon sur le plateau du bain et positionner la plate-forme au milieu.
   REMARQUE: Le savon diminue la tension de surface de l’eau; mouches qui touchent l’eau se noieront. Cela empêche l’augmentation des quantités de mouches volant dans la boîte pendant la progression de la session expérimentale.
2. Placez la boîte transparente sur le plateau et illuminez la plate-forme d’en haut à l’aide d’une lampe.
   REMARQUE: L’éclairage de la plate-forme est principalement nécessaire pour assurer un contraste vidéo approprié. Une lumière LED ordinaire de 12 V est appropriée pour ceci.
3. Placez la webcam directement au-dessus de la plate-forme (en dehors de la boîte) et connectez-la à un ordinateur.
4. Créez de nouveaux dossiers sur l’ordinateur pour stocker les différentes données expérimentales avant les expériences.
   1. Suivez la structure de l’exemple illustré dans la figure 2A pour créer les dossiers. Par exemple, si la conception expérimentale nécessite de tester deux génotypes avec cinq répliques chacun, créez d’abord un dossier principal contenant la date de l’expérience. À l’intérieur du dossier principal, créez deux sous-folders (un par génotype). À l’intérieur des dossiers génotype, créez cinq nouveaux sous-folders, un par réplique.
      REMARQUE: Pour une analyse plus approfondie, il est essentiel que les séries d’images correspondant à des expériences individuelles soient enregistrées dans des dossiers avec des noms uniques.

5. Configuration des paramètres vidéo dans la section « Dispositif de capture » de l’interface

1. Ouvrez le logiciel d’enregistrement d’images et, sous l’onglet « Capture », cliquez sur « Time-Lapse Images... » et sélectionnez la webcam appropriée comme « Dispositif de capture ».
2. Placez une mouche morte sur l’île; ajuster les paramètres vidéo en cliquant sur la case « Paramètres vidéo ». Faites défiler les barres d’outils, en ajustant la luminosité, le contraste et la couleur d’une manière telle que la mouche morte apparaît noire sur un fond blanc (figure 2B). Lorsque les ajustements sont terminés, cliquez sur « Ok ».

6. Configuration des paramètres d’enregistrement et d’enregistrement vidéo dans la section « Time-lapse » de l’interface

1. Ajustez les paramètres de la configuration du film Time-Lapse pour enregistrer l’expérience en tant que .avi fichier. Cliquez sur « Parcourir... », sélectionnez l’annuaire où le film sera stocké, définissez le nom de la vidéo et appuyez sur « enregistrer ».
   REMARQUE: Le fichier vidéo n’est pas utilisé pour la quantification des données; cependant, il pourrait être utile d’avoir une idée globale de l’expérience.
2. Ajustez les paramètres dans la section « Time-Lapse Movie Setup ».
   1. Dans la boîte de compression, sélectionnez « Code Intel IYUV » pour la compression vidéo et choisissez « Prenez un cadre toutes les 0,1 seconde », avec le « taux de lecture (images par seconde) » à 10.
   2. Enregistrez la série de temps d’expérience .bmp cadres en cliquant sur « Avancé... » Sélectionnez « Créer une image .bmp pour chaque image capturée ». Cliquez sur « Parcourir ». Sélectionnez le même répertoire dans la fenêtre « Pendant la capture de film AVI » (tel que choisi à l’étape 6.1), cliquez sur « Ouvrir », et appuyez sur « Ok ».
      REMARQUE: Notez que, pendant l’expérience, les images sont stockées comme .bmp fichiers (requis pour l’analyse des données). Le programme nomme les images comme « A » suivies du nombre correspondant à la séquence de capture du cadre(p. ex.,« A_number.bmp »)(figure 2C). Enregistrez toujours les images appartenant à différentes expériences dans un nouveau dossier pour vous assurer que les séries d’images précédemment enregistrées ne seront pas écrasées. Sachez que les images ne sont pas automatiquement enregistrées dans le même dossier que le fichier vidéo à moins que ce dossier ne soit sélectionné sous « Parcourir... » en cliquant sur la case « Advanced ».

7. Analyse de l’île et collecte de données

1. Appuyez sur le bouton de démarrage dans l’interface d’image time-lapse du logiciel d’enregistrement d’images pour démarrer l’enregistrement.
2. Appuyez sur le flacon expérimental contenant des mouches (étape 3) 2-3 fois pour vous assurer que les mouches sont au fond du flacon. Retirez rapidement le bouchon du flacon et, avec un mouvement vigoureux, appuyez sur le flacon sur la plate-forme de sorte que toutes les mouches tombent sur la plate-forme en même temps (Figure 1C).
3. Après environ 30 s, appuyez sur le bouton « Stop » pour arrêter l’enregistrement.
   REMARQUE: Si toutes les mouches disparaissent de la plate-forme, l’enregistrement peut être arrêté plus tôt.
4. Retirez les mouches qui restent pendant 30 s sur la plate-forme à la main après avoir arrêté l’enregistrement de l’image.
5. Avant de procéder à l’enregistrement de l’expérience suivante, modifiez l’annuaire cible .bmp fichiers et films (voir la section 6).

Figure 1 : Flowchart décrivant les exigences, la procédure expérimentale et l’analyse de l’analyse de l’île. (A) Équipement d’analyse de l’île. (B) Configuration expérimentale pour l’essai de l’île. (C) Essai de l’île. (D) Traitement des données d’analyse de l’île avec la macro" Drosophila Island Assay « . La macro «Drosophila Island Assay » est composée de 3 sous-macros : 1) font la pile et la projection, 2) définissent la plate-forme, et 3) l’analyse. (E) Traitement et évaluation statistique des données à l’aide du script « Island Assay Analysis ». S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Exemples de différents ajustements requis au cours du protocole. (A) La structure d’annuaire requise dans laquelle les expériences d’analyse de l’île doivent être stockées pour le traitement et l’analyse des données. (B) Lors de l’ajustement des paramètres vidéo, les mouches doivent apparaître noires sur un fond blanc. (C) Fichiers de sortie de trame d’image enregistrés par le logiciel d’enregistrement d’images décrit dans ce manuscrit. (D) Le contour jaune montre la sélection de la plate-forme. La sélection de plate-forme stockée dans le « ROI Manager » est mise en surbrillance en bleu. (E) Les mouches sont représentées sous forme de points blancs lors de l’ajustement du « réglage de la taille minimale des mouches ». La fenêtre de résultats montre la zone des mouches en pixels. (F) Exemple d’un seul cadre d’image enregistré (à gauche) et le cadre correspondant dans la pile d’images résultante, obtenu avec le« Drosophila Island Assay » macro (sur la droite). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.