Неспецифические Сигма активность протеаз Пробирной - казеин, как субстрата

Перед началом анализа, мы должны убедиться, что следующие реагенты правильно подготовлены: 50 мМ буфера фосфата калия, рН 7,5. Подготовка использованием 11,4 мг / мл, калия фосфат двузамещенный, тригидрат в очищенной воде и корректировки рН 1 М HCl. Это решение находится при температуре 37 ° С до использования. 0,65% вес / объем казеин раствор, приготовленный путем смешивания 6,5 мг / мл казеина в 50 мМ фосфатного буфера калия. Постепенно увеличилась температура раствора при осторожном перемешивании до 80-85 ° С в течение приблизительно 10 минут до однородной дисперсии достигается. Очень важно не кипятить раствор. РН затем корректируются при необходимости с NaOH и соляной кислоты. 110 мМ трихлоруксусной кислоты, подготовленные путем разбавления 6.1N 1:55 акции с очищенной водой. Трихлоруксусной кислоты является сильной кислотой и должны использоваться с большой осторожностью. 0,5 мМ Фолина & Ciolcaltea, или фенол реагента Фолина, которая является решением, которое будет вступать в реакцию с тирозин генерировать измеримые изменения цвета, который будет напрямую связан с активностью протеаз. Фенол реагента Фолина является кислотой и следует обращаться с осторожностью. 500 мМ раствор карбоната натрия, подготовлен с использованием 53 мг / мл anyhydrous карбоната натрия в очищенной воде. Раствора фермента разбавителя, который состоит из 10 мМ буферного раствора ацетата натрия с 5 мМ ацетат кальция, рН 7,5, при 37 ° C. Это решение, что мы используем для растворения твердых образцов протеазы или разбавленного фермента решений. 1,1 мм L-тирозин стандартного раствора состава. Подготовлено использовании 0,2 мг / мл L-тирозин в очищенной воде и нагревают мягко, пока тирозин растворяется. Как и казеин, не кипятить это решение. Разрешить L-тирозин стандартные для охлаждения до комнатной температуры. Это решение будет разбавляться дальше, чтобы наши стандартной кривой. Протеазы решение. Непосредственно перед использованием, растворить протеазы в раствор фермента разбавителя подготовлен в шаге 6. Если необходимо, используйте твердого образца протеазы предопределенных деятельности, которая растворяется использованием фермента разбавителя до 0,1-0,2 ЕД / мл. Это решение служит в качестве положительного контроля для анализа и контроля качества, как проверка для расчетов мы выполним для определения активности ферментов. Настройка Пробирной протеазы и стандартных кривых Чтобы начать этот анализ, найти подходящие флаконов, который будет содержать около 15 мл. Для каждого фермента, который будет проверяться, 4 флакона не требуется. Один флакон будет использоваться в качестве заготовки, а три других будут использованы для анализа деятельности трех разведений протеазы. Три разведения полезны при проверке окончательные расчеты друг против друга. Для каждого набора из четырех флаконов, добавьте 5mls нашей 0,65% казеина решение. Пусть они уравновешиваются на водяной бане при температуре 37 ° С в течение около 5 минут. Добавить различные объемы раствора фермента, которые будут проверены на три флакона тестовый образец, но не пустым. Смешать, вращая и инкубировать 37 ° С в течение ровно десять минут. Активность протеаз и косвенные освобождения тирозина в течение этого инкубационного периода, то и будет измерять и сравнивать между тестовыми образцами. После этого 10 минут инкубации, добавьте 5 мл TCA реагента в каждую пробирку, чтобы остановить реакцию. Затем добавьте соответствующий объем раствора фермента в каждую пробирку, даже пустой, так что конечный объем раствора фермента в каждую пробирку 1 мл. Это делается для учета поглощения значение самого фермента и гарантировать, что конечный объем в каждой пробирке равны. Инкубируйте растворов при 37 ° С в течение 30 минут. Во время этой 30-минутной инкубации, вы можете настроить тирозин стандартных разведений. Используйте 6 драм ампул (флаконов драма может быть заменена на полипропиленовые трубы), которые можно легко провести 8 мл. Для шесть флаконов, добавить 1,1 мм тирозин стандартные растворы со следующими объемов в мл: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Не добавляйте тирозин стандарт пустым. Нижняя стандарты могут быть необходимы для нечистых тестовых образцов, которые принесут небольшое изменение цвета. Как только тирозин стандартный раствор был добавлен, добавьте соответствующий объем очищенной воды для каждого из стандартов довести объем до 2 мл. После 30-минутной инкубации, фильтр каждый из тестовых решений и пустой использованием 0,45 мкм полиэфирсульфона шприц фильтр. Фильтрация необходима для удаления нерастворимых веществ из образцов. Добавить фильтрации 2 мл контрольных образцов и пустых фильтрата до 4 драма флаконов, который может содержать по меньшей мере 8 мл. Тот же самый тип флакона, в котором стандарты были подготовлены могут быть использованы. Для всех флаконах, содержащих стандарты и пустой, добавьте 5mls карбоната натрия. Для достижения наилучших результатов, добавьте 1 мл реагента Фолина сразу после этого. Добавить карбоната натрия для регулирования любых рН падение созданы путем добавления реагента Фолина в. Добавить карбоната натрия для опытных образцов и ТЭСт пустой. Эти решения становятся мутными после того карбоната натрия. Добавить реагента Фолина, которая будет реагировать в первую очередь со свободной тирозина. Смешайте драма флаконах, вращая и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 30 минут. После этой инкубации, вы заметите, что стандарты градации цвета, коррелирующие с количеством тирозина добавил, высокие концентрации тирозин появляются темные. Вы можете также заметить существенное изменение цвета в наших образцах. 2mls этих решений фильтруется с помощью 0,45 мкм полиэфирсульфона шприц фильтр в подходящую кювет. Теперь, когда анализ проводится, вы можете приступить к спектрофотометр для записи наших значения абсорбции. Измерение поглощения и расчета активности фермента Поглощения образцов измеряется спектрофотометром использованием длины волны 660 нм. Пути света установлен на 1см. Запись значения абсорбции для стандарты, стандартные заготовки, различные образцы тестов и тестирования пустой. После того как все данные были собраны, стандартная кривая может быть создан. В целях получения кривой, разница в абсорбции между стандартным и стандартным пустым должны быть рассчитаны. Это значение абсорбции обусловлены количеством тирозина в стандартных решений. После этого простой расчет, создать стандартную кривую использованием графической программы для построения Изменение поглощения наших стандартов по оси Y, по сравнению с суммы в мкмоль для каждого из наших 5 стандартов по оси X. Объем Тирозин Стандартный uMoles Тирозин 0,05 0,055 0,10 0,111 0,20 0,221 0,40 0,442 0,50 0,553 После точек данных были введены, генерировать линии наилучшего соответствия и соответствующего уравнения склону. Найти Изменение поглощения в исследуемых пробах путем вычисления разницы между поглощения исследуемого образца и поглощения тест пустым. Вставка значение абсорбции для одного из образцов в склон уравнения и решение приведет к мкмоль тирозина, выделяющейся при этом конкретной реакции протеолитических. Чтобы получить активность фермента в единиц / мл, выполните следующие расчеты: (Umole тирозин эквиваленты выпущен) х (11) Ед / мл фермента = __________________________________________ (1) х (10) х (2) 11 = Общий объем (в миллилитрах) пробирного 10 = Время анализа (в минутах) в соответствии с определением группы 1 = Объем ферментов (в миллилитрах) фермента использовали 2 = Объем (в миллилитрах), используемых в колориметрического определения Возьмем число мкмоль тирозина эквиваленты выпустили по наклону уравнение и умножить его на общий объем анализа в мл, которое в нашем случае 11mls. Разделите это число на три другие величины: время теста, который мы проводили в течение 10 минут, объем ферментов, используемых в анализе, который был разнообразный (давайте использовать 1 мл), объем миллилитров используются в колориметрических обнаружения, которые могут отличаться в зависимости от вашего кюветы. Мы использовали 2 мл. Мкмоль тирозина деленная на время в минутах, дает измерение активности протеазы называемые "единицы". Мы можем отменить из единицы для измерения объема в числителе и знаменателе, в результате чего Измерение активности фермента в единицах / мл. Для определения активности в твердый образец протеазы разводят в фермент разбавителя, мы разделим нашу деятельность в единицах / мл концентрация твердой, используемые в этом анализе, первоначально в мг / мл., Оставляя нас с деятельностью в единицах / мг . Ед / мл фермента Единиц / мг твердых = _____________________ мг твердых / мл фермента