הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג'ל
Summary
SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.
Abstract
צבירה עמילואיד קשורה רבים misfolding פתולוגיות חלבון בבסיס המאפיינים זיהומיות של פריונים, שהם conformationally עצמית בניית תבנית חלבונים, כי הם חשבו שיש תפקידים מועילים אורגניזמים נמוכה יותר. Amyloids היה קשה ללמוד לשמצה בשל שבחוסר שלהם הטרוגניות מבנית. עם זאת, החלטה של פולימרים עמילואיד על בסיס גודל שבחוסר אבקת כבר מתאפשרת על ידי חצי Denaturing דטרגנט-agarose ג'ל אלקטרופורזה (SDD-AGE). טכניקה זו היא למצוא שימוש נרחב לגילוי ואפיון של וריאנטים עמילואיד קונפורמציה. הנה, אנחנו מדגימים עיבוד של טכניקה זו המאפשרת את השימוש בו יישומים בקנה מידה גדול, כגון מסכי עבור פריונים הרומן amyloidogenic חלבונים אחרים. השיטה החדשה SDD-AGE משתמשת להעביר נימי של אמינות גדולה יותר וקלות השימוש, והוא מאפשר לכל ג'ל בגודל להיות לאכלס. לכן, מספר גדול של דגימות, שהוכן תאים או חלבונים מטוהרים, יכול להיות מעובד בו זמנית עבור נוכחות של SDS מסיס conformers של החלבונים המתויגים.
Protocol
Discussion
SDD-AGE דווח לראשונה על ידי Kryndushkin et al. 1, ללמוד SDS עמידים קומפלקסים של [PSI +] הפריון של שמרים, ומצא כי השימוש הנרחב ללמוד הן הפריון ואת הפריון הלא אגרגטים 2-9. עם זאת, העברה של חלבונים כדי אלקטרופורזה קרום הבאים ג'ל agarose הוא בעייתי, והוא יכול להביא תמונה כתם מעוות 5. בנוסף, טכניקה electroblotting שקוע הנפוץ ביותר מציג מגבלות מעשיות בגודל של הג'ל ולכן מספר דגימות כי יכול להיות מעובד. אנחנו צריכים לטפל בבעיות אלה על ידי המעסיק להעביר נימי כלפי מטה 10, הליך פשוט אשר משתמשת ערמת ניירות סופג יבש להעברת חלבונים מן הג'ל על קרום nitrocellulose. העברת נימי מונע עיוות ומאפשר ג'לים גדול להיות מעובד בנקל. יש כמה דברים לשקול לפני השימוש SDD-AGE. לקבלת דוגמיות גולמי (למשל, lysates), immunodetection של חלבונים מסוימים הוא הכרחי. SDD-AGE אינו מלא לפגל קומפלקסים חלבונים של עניין, כל כך את החלבון (ים) כדי להתגלות חייב לשאת תג epitope מחוץ לאזור amyloidogenic. Lysates יכולים בדרך כלל להיות מוכנים כפי שהם היו להיות נורמלי SDS-PAGE, עם שני הבדלים חשובים. ראשית, הטיפול חייב להילקח מוגברת כדי למנוע השפלה ידי proteolysis. התנאים חלקית denaturing משמש כאן אינם מספיקים כדי להשבית פרוטאזות, והוא יכול גם לייצר חלבונים היעד רגישים יותר proteolysis. השתמש קוקטייל להשלים מעכבי פרוטאז בריכוז לפחות כפולה מומלץ. שנית, חימום הדגימות יש להימנע. אם פקד כל מונומר שלילי הרצויה, למשל כדי לאשר גבוהה מולקולרית משקל מינים שאינם בשל שינויים קוולנטיים, דגירה של 10 דקות בשעה 95 ° C יכול לשמש, אשר תשחזר ביותר amyloids לחלבון monomeric.
Acknowledgements
אנו מודים סיימון אלברטי לסיוע בפיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי (GM25874), הווארד יוז רפואי Investigatorship המכון (ל SL), וכן הקרן הלאומית למדע מענק predoctoral הכשרה (עד ר"ה).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| zymolyase 100T | Seikagaku America | 120493-1 | ||
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78429 | ||
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | ||
| GB004 blotting paper | Whatman | 10427926 | ||
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman | 3030-917 | ||
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
- Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).
- Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).
- Allen, K. D., et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. 유전학. 169, 1227-1242 (2005).
- Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation.. The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase. Current Genetics. 49, 21-29 (2006).
- Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).
- Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability. Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).
- Douglas, P. M., et al. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).
- Nagy, B., Costello, R., Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).
