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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
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Disclosures
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신경과학

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Published: July 26, 2024
doi:
10.3791/67078
, ,
1Department of Biochemistry, Microbiology & Immunology,University of Saskatchewan

Summary

이 프로토콜은 배아 15-16일에 마우스 배아에서 분리한 일차 신경 세포와 출생 후 1-2일에 신생아 마우스의 뇌에서 생성된 일차 미세아교세포에서 확립된 미세아교세포-뉴런 공동 배양을 설명합니다.

Abstract

미세아교세포는 중추신경계(CNS)의 조직에 상주하는 대식세포로, 신경 건강과 중추신경계 항상성을 지원하는 다양한 기능을 수행합니다. 이들은 중추신경계 질환 활동과 관련된 면역 세포의 주요 집단으로, 다발성 경화증(MS)과 같은 만성 신경퇴행성 질환 중 신경 손상에 잠재적으로 기여하는 반응성 표현형을 채택합니다. 미세아교세포가 건강 및 질병 중 신경 기능과 생존을 조절하는 뚜렷한 메커니즘은 미세아교세포, 뉴런 및 기타 CNS 환경 요인 간의 복잡한 생체 내 상호 작용을 해결하는 데 어려움이 있기 때문에 제한되어 있습니다. 따라서 미세아교세포와 뉴런을 함께 배양하는 체외 접근법은 미세아교세포-뉴런 상호작용을 연구하기 위한 유용한 도구로 남아 있습니다. 여기에서는 생쥐에서 일차 미세아교세포와 뉴런을 생성하고 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 구체적으로, 미세아교세포는 출생 후 일 0-2일 사이에 신생아 마우스에서 유래한 뇌 균질액으로부터 확립된 혼합 신경교세포(glia) 배양으로부터 시험관내에서 9-10일 후에 분리하였다. 신경 세포는 배아 16-18일 사이에 마우스 배아의 뇌 피질에서 분리되었습니다. 시험관 내에서 4-5일 후, 신경 세포를 96웰 플레이트에 파종한 후 미세아교세포를 추가하여 공동 배양을 형성했습니다. 이 프로토콜은 두 세포 유형 모두 공동 배양을 확립하기 위해 실험적 성숙도에 도달해야 하기 때문에 신중한 타이밍이 중요합니다. 전반적으로 이 공동 배양은 미세아교세포-뉴런 상호 작용을 연구하는 데 유용할 수 있으며 면역형광 현미경 검사, 실시간 이미징, RNA 및 단백질 분석을 포함한 여러 판독값을 제공할 수 있습니다.

Introduction

미세아교세포(Microglia)는 중추신경계(CNS)의 면역감시 및 항상성을 촉진하는 조직 상주 대식세포입니다1,2,3. 난황낭 적혈구세포 전구세포(yolk sac erythromyeloid progenitor cell)에서 유래하며, 배아 발달 과정에서 뇌에 서식하며4,5,6 증식과 세포자멸사(apoptosis)를 수반하는 자가재생(self-renewal)을 통해 유기체의 수명 동안 유지된다7. 정상 상태에서, 휴지 상태의 미세아교세포는 형태학을 파급시키고 조직 감시에 참여한다 8,9,10.

미세아교세포는 수많은 세포 표면 수용체를 발현하여 중추신경계의 변화에 신속하게 반응할 수 있습니다11,12 감염 또는 조직 손상 시 염증 반응을 촉진할 수 있습니다.12,13,14 뿐만 아니라 다발성 경화증(MS)16,17과 같은 신경퇴행성 질환 9,15 동안에도 염증 반응을 촉진합니다. 미세아교세포는 또한 다양한 신경전달물질과 뉴로펩티드(18,19,20)에 대한 수용체를 발현하는데, 이는 이들이 또한 신경세포 활동에 반응하고 조절할 수 있음을 시사한다 21,22. 실제로, 미세아교세포와 뉴런은 막 단백질에 의해 매개되는 직접 상호작용 또는 용해성 인자 또는 중간 세포를 통한 간접 상호작용과 같은 다양한 형태의 양방향 통신(8,23)에서 상호작용한다(23,24).

예를 들어, 뉴런에 의해 분비되는 다양한 신경 전달 물질은 미세아교세포의 신경 보호 또는 염증 활동을 조절할 수 있습니다 25,26,27. 또한, 뉴런과 미세아교세포 사이의 직접적인 상호작용은 미세아교세포를 항상성 상태로 유지하는 데 도움이 된다28. 반대로, 미세아교세포와 뉴런의 직접적인 상호작용은 뉴런 회로(29)를 형성하고 뉴런 신호전달(30,31,32)에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 상호작용의 중단이 뉴런(30) 및 미세아교세포(microglia) 반응성(33,34)의 과흥분성을 유발하기 때문에, 조절되지 않는 미세아교세포-뉴런 상호작용은 신경계 질환(33,35)에 기여하는 요인으로 연루된다. 실제로, 정신병적질환 23,26 및 신경퇴행성 질환은 기능 장애(dysfunctional microglia-neuronal interactions)를 나타내는 것으로 설명되었다33. 이러한 관찰은 중추신경계에서 미세아교세포-신경세포 통신의 중요성을 강조하지만, 이러한 상호 작용이 건강과 질병에서 미세아교세포와 신경세포 기능을 조절하는 방법에 대한 구체적인 메커니즘은 상대적으로 알려져 있지 않습니다.

중추신경계(CNS)와 같은 복잡한 환경 내에서는 여러 환경 요인이 미세아교세포-신경세포 상호작용에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 생체 내에서 일시적인 세포 상호작용을 연구하는 능력을 제한합니다. 여기에서는 미세아교세포와 뉴런 사이의 직접적인 세포 상호작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 체외 미세아교세포-뉴런 공동 배양 시스템을 제시합니다. 이 프로토콜은 출생 후 0-2일과 배아 생쥐 16-18일 사이에 각각 신생아 마우스의 피질에서 일차 미세아교세포와 뉴런의 생성을 설명합니다. 그런 다음 뉴런과 미세아교세포를 다운스트림 고처리량 실험을 위해 96웰 플레이트에서 공동 배양합니다. 우리는 이전에 미세아교세포 식세포작용이 산화된 포스파티딜콜린 매개세포 사멸로부터 뉴런을 보호한다는 것을 입증하기 위해 이 접근법을 사용했으며, 이는 이 방법이 신경 퇴행 및 다발성 경화증의 맥락에서 미세아교세포의 역할을 이해하는 데 도움이 될 수 있음을 시사합니다. 유사하게, 미세아교세포-뉴런 공동배양은 바이러스 감염(viral infections)38 또는 신경세포 손상 및 복구(neuronal injury and repair)39와 같은 다른 상황에서 미세아교세포-뉴런 누화(microglia-neuronal crosstalk)의 영향을 조사하는 데에도 유용할 수 있다. 전반적으로, in vitro microglia-neuronal co-culture system을 통해 연구자들은 조작 가능하고 통제된 환경에서 microglia-neuronal 상호 작용을 연구할 수 있으며, 이는 in vivo 모델을 보완합니다.

Protocol

이 연구에 사용된 모든 동물은 서스캐처원 대학의 대학 동물 관리 위원회(UACC)와 캐나다 동물 관리 위원회(CCAC)의 승인을 받아 수용 및 처리되었습니다. 이 연구에는 출생 후 0-2일 CD1 수컷 및 암컷 마우스와 임신한 CD1 마우스의 배아 16-18일(E16-18) 배아가 사용되었습니다. 시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다. 1. 원발성 미세?…

Representative Results

미세아교세포에 대한 혼합신경교세포(mixed glia) 배양의 주요 단계를 보여주는 흐름도가 그림 1A에 나와 있습니다. 전반적으로, 1일차에는 희박한 세포와 과도한 세포 파편이 예상됩니다(그림 1B). 4일째가 되면 특히 부착성 성상세포(adherent astrocyte)의 생성과 함께 세포 수가 증가하는 것이 관찰되어야 하며, 이는 길쭉한 형태에서 알 수 있습니다(<strong class…

Discussion

이 논문에서는 생쥐의 1차 뉴런과 1차 미세아교세포를 분리하고 배양하기 위한 프로토콜에 대해 설명하며, 이후 미세아교세포와 미세아교세포의 상호 작용이 세포 건강과 기능을 조절하는 방법을 연구하는 데 사용할 수 있는 미세아교세포-신경세포 공동 배양을 확립하는 데 사용됩니다. 이 비교적 간단하고 접근하기 쉬운 접근법은 중추신경계에서 미세아교세포 뉴런 상호작용의 메커니즘과 기?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

JP는 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada)와 서스캐처원 대학교 의과대학(University of Saskatchewan College of Medicine)의 자금 지원을 인정합니다. YD는 University of Saskatchewan College of Medicine Startup Fund, 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 Discovery Grant(RGPIN-2023-03659), MS Canada Catalyst Grant(1019973), Saskatchewan Health Research Foundation Establishment Grant(6368) 및 Brain Canada Foundation Future Leaders in Canadian Brain Research Grant의 자금 지원을 인정합니다. 그림 1A, 그림 2A 및 그림 3A 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

Materials

10 cm Petri dish  Fisher  07-202-011 Sterile
1x Versene Gibco 15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System  Gibco  A3653401
Dissection microscope VWR
DNase I Roche 11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11960-044
Fetal Bovine Serum  ThermoFisher Sci 12483-020
HBSS (10x) Gibco 14065-056
Hemacytometer Hausser Scientific 1475
HEPES  ThermoFisher Sci 15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x) Fisher Scientific  21083027
Macrophage colony stimulating factor  Peprotech 315-02
Micro-Forceps RWD F11020-11 Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids Cytiva SH3023801
PBS (10x) ThermoFisher Sci AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x) Gibco 103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide  Sigma P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
Spring scissors RWD S11008-42 Autoclaved/Sterile
Surgical blade Feather 08-916-5D Sterile
T-25 flasks Fisher 10-126-9
T-75 flasks  Fisher 13-680-65
Tissue forceps Codman 30-4218 Autoclaved/Sterile
Tissue scissors RWD S12052-10 Autoclaved/Sterile
Trypan Blue  Thermofisher Sci  15250-061
Trypsin (2.5%) ThermoFisher Sci 15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope Zeiss
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References

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