طرق لتمكين النسخ المكاني لأنسجة العظام
Summary
هنا ، نصف طريقة تسمح بإزالة الكلس من أنسجة العظام التي تم الحصول عليها حديثا والحفاظ على الحمض النووي الريبي عالي الجودة. كما تم توضيح طريقة لتقسيم عينات الفورمالين الثابتة من البارافين (FFPE) للعظام غير المنزوعة المعادن للحصول على نتائج جيدة النوعية إذا لم تكن الأنسجة الطازجة متوفرة أو لا يمكن جمعها.
Abstract
يعد فهم العلاقة بين الخلايا وموقعها داخل كل نسيج أمرا بالغ الأهمية للكشف عن العمليات البيولوجية المرتبطة بالتطور الطبيعي وأمراض الأمراض. النسخ المكاني هو طريقة قوية تمكن من تحليل النسخ بالكامل داخل عينات الأنسجة ، وبالتالي توفير معلومات حول التعبير الجيني الخلوي والسياق النسيجي الذي توجد فيه الخلايا. في حين تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع للعديد من الأنسجة الرخوة ، إلا أن تطبيقها لتحليل الأنسجة الصلبة مثل العظام كان صعبا. يكمن التحدي الرئيسي في عدم القدرة على الحفاظ على الحمض النووي الريبي عالي الجودة ومورفولوجيا الأنسجة أثناء معالجة عينات الأنسجة الصلبة للتقسيم. لذلك ، يتم وصف طريقة هنا لمعالجة عينات أنسجة العظام التي تم الحصول عليها حديثا لإنشاء بيانات النسخ المكاني بشكل فعال. تسمح هذه الطريقة بإزالة الكلس من العينات ، ومنح أقسام الأنسجة الناجحة مع الحفاظ على التفاصيل المورفولوجية مع تجنب تدهور الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير إرشادات مفصلة للعينات التي كانت في السابق مدمجة في البارافين ، دون إزالة المعادن ، مثل العينات التي تم جمعها من بنوك الأنسجة. باستخدام هذه الإرشادات ، يتم عرض بيانات النسخ المكاني عالية الجودة الناتجة عن عينات بنك الأنسجة للورم الأولي وورم خبيث في الرئة من ساركوما العظام العظمية.
Introduction
العظام هي نسيج ضام متخصص يتكون أساسا من ألياف الكولاجين من النوع 1 والأملاح غير العضوية1. نتيجة لذلك ، تكون العظام قوية وقاسية بشكل لا يصدق بينما تكون ، في نفس الوقت ، خفيفة ومقاومة للصدمات. القوة الكبيرة للعظام مستمدة من محتواها المعدني. في الواقع ، بالنسبة لأي زيادة معينة في النسبة المئوية للمحتوى المعدني ، تزداد الصلابة بمقدار خمسة أضعاف2. وبالتالي ، يواجه الباحثون مشاكل كبيرة عندما يحللون ، عن طريق التقسيم النسيجي ، بيولوجيا عينة العظام.
علم الأنسجة العظمي غير المكلس ممكن ومطلوب في بعض الأحيان ، اعتمادا على نوع التحقيق (على سبيل المثال ، لدراسة البنية الدقيقة للعظام) ؛ ومع ذلك ، فإنه يمثل تحديا كبيرا ، خاصة إذا كانت العينات كبيرة. في هذه الحالات ، تتطلب معالجة الأنسجة للأغراض النسيجية عدة تعديلات على البروتوكولات والتقنيات القياسية3. بشكل عام ، لإجراء التقييمات النسيجية الشائعة ، يتم إزالة الكلس من أنسجة العظام مباشرة بعد التثبيت ، وهي عملية قد تتطلب بضعة أيام إلى عدة أسابيع ، اعتمادا على حجم الأنسجة وعامل إزالة الكلس المستخدم4. غالبا ما تستخدم المقاطع منزوعة الكلس لفحص نخاع العظام ، وتشخيص الأورام ، إلخ. هناك ثلاثة أنواع رئيسية من عوامل إزالة الكلس: الأحماض القوية (مثل حمض النيتريك وحمض الهيدروكلوريك) والأحماض الضعيفة (مثل حمض الفورميك) وعوامل المخلب (على سبيل المثال ، حمض الإيثيلين ديامينيتريستيك أو EDTA)5. يمكن للأحماض القوية إزالة الكلس من العظام بسرعة كبيرة ، لكنها يمكن أن تلحق الضرر بالأنسجة. الأحماض الضعيفة شائعة جدا ومناسبة للإجراءات التشخيصية ؛ تعتبر العوامل المخلبية إلى حد بعيد الأكثر استخداما وملاءمة للتطبيق البحثي لأنه في هذه الحالة ، تكون عملية إزالة المعادن بطيئة ولطيفة ، مما يسمح بالاحتفاظ بالتشكل عالي الجودة والحفاظ على معلومات الجينات والبروتين ، كما هو مطلوب في العديد من الإجراءات (على سبيل المثال ، التهجين في الموقع ، التلوين المناعي). ومع ذلك ، عندما يحتاج النسخ بأكمله إلى الحفاظ عليه ، مثل تحليلات التعبير الجيني ، حتى إزالة المعادن البطيئة واللطيفة قد تكون ضارة. لذلك ، هناك حاجة إلى نهج وطرق أفضل عندما يحتاج التحليل المورفولوجي للأنسجة إلى الاقتران بتحليلات التعبير الجيني للخلايا.
بفضل التحسينات الأخيرة في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) والنسخ المكاني ، أصبح من الممكن الآن دراسة التعبير الجيني لعينة الأنسجة حتى عند استخدام تضمين البارافين لتثبيت الفورمالين (FFPE) لتخزين عينات الأنسجة6،7،8. وقد فتحت هذه الفرصة الوصول إلى عدد أكبر من العينات، مثل تلك المخزنة في بنوك المناديل الورقية في جميع أنحاء العالم. إذا كان سيتم استخدام scRNA-seq ، فإن سلامة الحمض النووي الريبي هي أهم مطلب. ومع ذلك ، في حالة النسخ المكاني لعينات FFPE ، فإن كل من أقسام الأنسجة عالية الجودة والحمض النووي الريبي عالي الجودة ضروريان لتصور التعبير الجيني في السياق النسيجي لكل قسم من الأنسجة. في حين أن هذا قد تحقق بسهولة مع الأنسجة الرخوة ، لا يمكن قول الشيء نفسه عن الأنسجة الصلبة مثل العظام. في الواقع ، على حد علمنا ، لم يتم إجراء أي دراسة باستخدام النسخ المكاني على عينات عظام FFPE. هذا بسبب عدم وجود بروتوكولات يمكنها معالجة أنسجة العظام FFPE بشكل فعال مع الحفاظ على محتوى الحمض النووي الريبي الخاص بها. هنا ، يتم توفير طريقة لمعالجة وإزالة الكلس من عينات أنسجة العظام التي تم الحصول عليها حديثا مع تجنب تدهور الحمض النووي الريبي أولا. بعد ذلك ، إدراكا للحاجة إلى تحليل النسخ لعينات FFPE التي تم جمعها في بنوك الأنسجة في جميع أنحاء العالم ، يتم أيضا تقديم إرشادات مطورة للتعامل بشكل صحيح مع عينات FFPE من العظام غير المنزوعة المعادن.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم توفير طريقة مفصلة لإعداد كتل FFPE من العظام منزوعة الكلس والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي للتسلسل (أي تسلسل الجيل التالي (NGS)) أو للتقنيات الأخرى المتعلقة بالحمض النووي الريبي (أي التهجين في الموقع ، تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR) ، إلخ).
<p class="jove_content…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بأموال من بيتسبرغ لعلاج الساركوما (PCS) ومعهد الساركوما العظمية (OSI).
Materials
| Advanced orbital shaker | VWR | 76683-470 | Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions. |
| Camel Hair Brushes | Ted Pella | 11859 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Dual Index Kit TS Set A 96 rxns | 10X Genomics | PN-1000251 | Use to perform spatial transcriptomics. |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs Inc | 2701 | Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions. |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | S312-500 | Use to prepare EDTA 20% pH 8.0. |
| Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Fine Precision Probe | Fisher Scientific | 12-000-153 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines. |
| High profile diamond microtome blades | CL Sturkey | D554DD | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Novaseq 150PE | Novogene | N/A | Sequencer. |
| Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS to perform tissue fixation. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions. |
| Premiere Tissue Floating Bath | Fisher Scientific | A84600061 | Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines. |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 7002 | Use to clean all surfaces as reported in the method instructions. |
| RNeasy DSP FFPE Kit | Qiagen | 73604 | Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines. |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | S8045-500 | Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water. |
| Space Ranger | 10X Genomics | 2.0.1 | Use to process sequencing data output . |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions. |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000194 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Human Transcriptome Probe Kit Small | 10X Genomics | PN-1000363 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000188 | Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments. |
| Xylene | Leica Biosystems | 3803665 | Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions. |
References
- Baig, M. A., Bacha, D. . Histology. Bone. , (2024).
- Currey, J. D. The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone. J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).
- Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. (35), e1707 (2010).
- Wallington, E. A. . Histological Methods for Bone. , (1972).
- Callis, G. M., Sterchi, D. L. Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology. J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).
- Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies. Int J Genomics. 2017, 1926304 (2017).
- Trinks, A., et al. Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue. Cell Oncol (Dordr). , (2024).
- Xu, Z., et al. High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq. Nat Commun. 14 (1), 2734 (2023).
- 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE – User Guide., Document Number C CG000407 Rev C. 10x Genomics. , (2021).
- 10x Genomics. Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A. 10x Genomics. , (2022).
- 10x Genomics. Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D. 10x Genomics. , (2022).
