Inoculeren en observeren van arbusculaire mycorrhizaculturen op superabsorberende autotrofe systemen op basis van polymeren

1. Modificatie van petrischalen met twee compartimenten OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen. Wijzig het deksel van de petrischaal.Boor met behulp van het roterende gereedschap en de bijbehorende snijbit twee gaten (~7 mm in diameter) in de bovenkant van het deksel en een opening van 1 cm in de zijkant. Het ene gat wordt gebruikt om het wortelcompartiment (vermiculiet) te irrigeren en het andere voor het hyfen (SAP) compartiment. Wijzig de bodem van de petrischaal.Boor een inkeping in de zijkant van de bodem van de petrischaal voor de stengel van de plant met behulp van het elektrische roterende gereedschap. Zorg ervoor dat de inkeping niet te diep is om te voorkomen dat de vloeistof wegloopt. Deze inkeping wordt uitgelijnd met de opening van 1 cm in het deksel (stap 1.1). Om de plastic barrière van de petrischaal met twee compartimenten te vervangen door het nylon gaasfiltermembraan, gebruikt u het elektrische roterende gereedschap om een rechthoekige inkeping van 30 mm naar de bodem van de petrischaal te boren. Voor observatie met hoge resolutie boort u ronde gaten met een diameter van ~25 mm in de bodem van de petrischaal. Maak afhankelijk van de vereisten een enkel gat (of meerdere gaten) aan de SAP-zijde of één in elk compartiment. Zorg ervoor dat de gaten niet direct onder de irrigatiegaten van het deksel worden geboord. Installeer het membraan van het nylon gaasfilter.Gebruik de metalen geleider en paperclip om het stuk van het nylon gaasfiltermembraan op zijn plaats te klemmen en stevig op de plastic barrière te drukken. Lijn de bovenkant van het membraan uit met de bovenkant van de plastic barrière. Zorg ervoor dat het membraan uit de onderkant van de geleider steekt. Snijd met behulp van de pyrografieset langs de rand van de metalen geleider om het membraan te smelten en af te dichten aan de bodem van de petrischaal en de plastic barrière die de twee compartimenten scheidt. Terwijl de metalen geleider en paperclip nog op hun plaats zitten, verwijdert u voorzichtig het overtollige nylon gaasfiltermembraan met een pincet. Controleer onder de ontleedmicroscoop of het nylon gaasfiltermembraan goed is afgedicht op het plastic om te voorkomen dat wortels in het hyfale (SAP) compartiment binnendringen. Installeer het dekglaasje.LET OP: Het dekglaasje wordt onder de petrischaal geplaatst. Hierdoor kan de immersieolie worden gebruikt en kan het dekglaasje worden gereinigd.Breng de siliconenkit aan langs de rand van de ronde gaten (buiten de bodem van de petrischaal). Plaats het dekglaasje op de buitenkant van de bodem van de petrischaal en druk voorzichtig aan om een perfecte hechting te garanderen. Laat drogen en verwijder overtollige kit met een scheermesje. Inspecteren en schoonmaken.Gebruik een luchtstoot om stof of stukjes plastic te verwijderen die zich aan de petrischaal hebben gehecht. Inspecteer onder een ontleedmicroscoop om eventuele defecten op te sporen en te corrigeren.OPMERKING: Draag handschoenen om vingerafdrukken op de petrischaaltjes te voorkomen 2. Bereiding van 1 L voedingsoplossing mMS-1 Bereid voorraadoplossingen voor.Macronutriënten: Weeg en los het volgende op in 1 L gedestilleerd water:7,31 g MgSO4·7 H2O, 0,80 g KNO3, 0,65 g KCl en 0,048 g KH2PO4. Weeg 2,88 g Ca(NO3)2 af.4H2O en oplossen in 1 L gedestilleerd water. Weeg 0,80 g NaFeEDTA af en los op in 0,5 l gedestilleerd water. Weeg 0,375 g KI af en los op in 0,5 l gedestilleerd water. MicronutriëntenLos 3 g MnCl2 op.4H2O in 100 ml gedestilleerd water. Los 1.325 g ZnSO4 op7H2O in 100 ml gedestilleerd water. Los 0,75 g H3BO3 op in 100 ml gedestilleerd water. Als ze zijn opgelost, meng dan de in de stappen 2.1.5.1-2.1.5.3 bereide oplossingen. Weeg 0,65 g CuSO4 af.5H2O en oplossen in 50 ml gedestilleerd water. Los 0,12 g Na2MoO4 op·2H2O in 100 ml gedestilleerd water. Voeg 5 ml van de oplossing uit stap 2.1.5.5 en 1 ml uit stap 2.1.5.6 toe aan de oplossing uit stap 2.1.5.4. Stel het volume van de in stap 2.1.5.7 verkregen oplossing in op 500 ml met gedestilleerd water. Bereid 1 L mMS-1 media voor.Voeg 700 ml gedestilleerd water toe aan een glazen fles van 2 liter. Voeg onder voortdurend roeren met een magnetische staaf 100 ml oplossing van macronutriënten toe (stap 2.1.1), 100 ml calciumnitraatoplossing (stap 2.1.2), 5 ml ijzer-EDTA-oplossing (stap 2.1.3), 1 ml KI-oplossing (stap 2.1.4) en 1 ml oplossing van micronutriënten (stap 2.1.5). Stel het volume van de oplossing in op 1000 ml.OPMERKING: mMS-1 is een bewerking van Bécard en Fortin (1988)14. Sterilisatie bij 121 °C gedurende 15 minuten is optioneel omdat de SAP-AS niet steriel is. De pH wordt niet aangepast omdat de SAP een sterk bufferend effect heeft, en Paré et al. (2022)12 toonden aan dat de omstandigheden op SAP relatief neutraal waren (6,7 tot 7,4). 3. Voorbereiding van SAP OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen. Hydrateer SAP: meng 5 g droge SAP met 500 ml mMS-1 voedingsoplossing (stap 2.2). Laat 12 uur (een nacht) hydrateren bij kamertemperatuur (RT). Giet af en verzamel de gehydrateerde SAP-korrels.Wanneer gehydrateerde SAP wordt gebruikt om de plaat met 12 putjes te vullen (sectie 7), laat de gehydrateerde SAP dan niet uitlekken en meng het gehydrateerde graan en de restanten van de mMS-1-voedingsoplossing.OPMERKING: Er zijn drie granulometrieën van de droge SAP beschikbaar: klein, middelgroot en groot. De gemiddelde granulometrie (1-2 mm) is het meest geschikt. De SAP van grote granulometrie slikt te veel wanneer het gehydrateerd is en het deksel van de petrischaal kan niet worden gesloten, terwijl de kleine granulometrie SAP weinig ruimte tussen hen laat, wat een beperking is voor de waarnemingen van de schimmelstructuur tussen de korrels. 4. Voorbereiding van zaailingen OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen. Ontkiem de zaden van P. lanceolata op vloeipapier bevochtigd met mMS-1 voedingsoplossing in een petrischaaltje. Incubeer in het donker bij RT. Rehydrateer indien nodig tot de worteltjes minstens 2 cm lang zijn. 5. Assemblage en beheer van SAP-AS OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen. SAP-AS monteren (stap 1 + stap 2 + stap 3 + stap 4)Plaats de stengel van de zaailing in de inkeping aan de zijkant van de petrischaal met de wortel naar binnen en de zaadlobben/bladeren en stengels naar buiten. Bedek de wortels met ongeveer 1,5-2 g vermiculiet. Hydrateer het wortelcompartiment met 8 ml mMS-1 voedingsoplossing. Dit zal helpen de wortel en vermiculiet te stabiliseren. Voeg 5 g gehydrateerd SAP toe langs het nylon gaasfiltermembraan aan de zijkant van het wortelcompartiment. Voeg 15 g gehydrateerde SAP toe aan het hyfhalcompartiment. Het hyfhalcompartiment is het compartiment zonder inkeping aan de zijkant van de bodem van de petrischaal. Voordat u de petrischaal met het deksel sluit, moet u ervoor zorgen dat de zij-inkepingen van het deksel en de bodem van de petrischaal op één lijn liggen om de steel niet te beschadigen. Sluit de petrischaal af met een strook paraffine die de bodem en het deksel verbindt, zorg ervoor dat de jonge stengel niet wordt geplet. Weeg en noteer het gemiddelde gewicht van de petrischaal om te bepalen wanneer de SAP-AS opnieuw moet worden gehydrateerd. Stapel de petrischaaltjes op elkaar om de ruimte te optimaliseren. Houd de petrischaal in het donker met behulp van een ondoorzichtig deksel met een opening aan de zijkant voor de zaailingen. SAP-AS beheren.Hydrateer de petrischaaltjes alleen met mMS-1 voedingsoplossing. Gebruik het gemiddelde gewicht als referentie. Wanneer de petrischaal 5-6 g lichter is geworden, voeg dan mMS-1 voedingsoplossing toe om deze terug te brengen naar het oorspronkelijke gewicht. Zorg ervoor dat het vermiculiet en SAP gehydrateerd blijven, maar niet overstroomd. Wortels moeten toegang hebben tot zuurstof. Naarmate de zaailing en zijn schimmelpartner zich ontwikkelen, moet u ze vaker irrigeren. Het is niet nodig om beide compartimenten tegelijkertijd water te geven. De irrigatievereisten variëren afhankelijk van de ontwikkeling van de zaailingen, maar ook afhankelijk van de omgevingsomstandigheden waarin SAP-AS wordt geïncubeerd. Verminder de irrigatiebehoefte door oude bladeren te verwijderen als de plant meer dan drie gezonde bladeren heeft. Verwijder dode bladeren.OPMERKING: De aanwezigheid van kationen zoals K+, Mg2+ en Ca2+ in de mMS-1-voedingsoplossing heeft de neiging om de uitbreiding van het SAP-netwerk13 in de loop van de tijd te verminderen. 6. Inoculatie van de SAP-AS met een enkele spore OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen. Inoculeer met een enkele spore.Verwarm de glazen pipet met een vlamkaars of bunsenbrander. Trek terwijl het glas smelt om de glazen buis uit te rekken totdat deze loskomt. Breek onder een stereomicroscoop de punt van de glazen pipet om de inwendige diameter te verkleinen (meestal 100-300 μm). Dit zal de manipulatie van individuele sporen aanzienlijk vergemakkelijken. Open de petrischaal, zoek de plek waar de spore moet worden geplaatst en maak een ruimte vrij tussen de 5 g gehydrateerde SAP langs het nylon gaasfiltermembraan om een deel van een wortel bloot te leggen. Pak onder de ontleedmicroscoop een spore op met de geëxtrudeerde pipet. Pipeteer wat vloeistof voordat u de spore pipetteert. Vermijd pipetteervloeistof na het verzamelen van de spore. Breng de spore onder de ontleedmicroscoop voorzichtig aan op de wortel. De vloeistof die voor het pipetteren van de spore wordt gepipetteerd, helpt de spore te verdrijven. Als de spore niet op een optimale plaats wordt afgezet, gebruik dan een acupunctuurnaald of borstelhaar om de spore weer in contact te brengen met de wortel. Maak indien nodig een foto van de spore die op de wortel is afgezet ter referentie en gebruik een marker om de inoculatieplaats te lokaliseren. Vervang de SAP over het wortelfragment om een vochtige micro-omgeving voor de wortel en spore te bieden. Wacht minstens 24 uur voordat je het wortelcompartiment bevloeit en pas op dat je de sporen niet van de wortel afspoelt. Voordat u de petrischaal met het deksel sluit, moet u ervoor zorgen dat de zij-inkepingen van het deksel en de bodem van de petrischaal op één lijn liggen om de stengel van de zaailing niet te beschadigen.OPMERKING: De SAP-AS is klaar voor inoculatie wanneer de wortels het nylon gaasfiltermembraan bereiken, idealiter een paar dagen na irrigatie, dus er is geen vrije vloeistof. 7. Sporenontkieming op SAP (optioneel) OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen. Ontkieming van sporen.Meng het gehydrateerde SAP om een gladde textuur te verkrijgen (zie stap 3.3.1). Luchtbellen verdwijnen meestal binnen 24 uur of door het mengen van het gemengde SAP (optioneel) te autoclaveren. Gebruik een spuit van 20 ml zonder naald om ongeveer 2 g (overeenkomend met 2 ml) gemengd SAP in elk putje van de plaat met 12 putjes te pipetteren. Selecteer een spore onder de ontleedmicroscoop en gebruik de geëxtrudeerde pipet zoals beschreven in sectie 6. Plaats onder de ontleedmicroscoop een spore in het midden van elk putje. Incubeer de plaat met 12 putjes in het donker bij RT en controleer regelmatig de kieming. Selecteer onder de ontleedmicroscoop een spore met een groeiende hyfen (minstens enkele millimeters lang). Voeg 1 ml mMS-1 voedingsoplossing toe aan het putje en wacht een paar minuten totdat het medium vloeibaarder is geworden. Gebruik indien nodig de acupunctuurnaald om de sporen en hyfen voorzichtig uit het substraat te verwijderen. Verzamel de sporen met een pipet of door de wortels van een zaailing naar het oppervlak van het medium te brengen om de sporen en hyfen aan de wortels te plakken. Plaats de zaailing vervolgens in de petrischaal zoals beschreven in stap 5.1.3.OPMERKING: Coördineer het ontkiemen van sporen en de groei van zaailingen. Deze methode is alleen getest met R . irregularis sporen. 8. Live monitoring van de ontwikkeling van de symbiose OPMERKING: De materialen die nodig zijn voor deze stap staan vermeld in de Tabel met materialen. Observeer routinematig met een ontleed-, rechtopstaande of omgekeerde microscoop.Bekijk de bovenkant van elk compartiment 20x – 40x met behulp van een ontleedmicroscoop met witte verlichting en donker veld. Als er geen omgekeerde microscoop beschikbaar is, observeer dan de bodem van elk compartiment met een ontleed- of rechtopstaande microscoop door de petrischaal om te keren. Voordat u de petrischaal omkeert, laat u de SAP-AS 2 dagen drogen zodat de SAP iets aan de bodem van de petrischaal hecht. Maak gedetailleerde waarnemingen op 40x door de bodem van de petrischaal en tot 100x (olie-onderdompeling) door het dekglaasje. Observeer sporen en hyfale netwerken.OPMERKING: De schimmelstructuren die zich in de SAP-korrels ontwikkelen, kunnen worden gekleurd.Bereid een inkt- en azijnoplossing voor volgens Vierheilig et al. (1998)15. Niet verwarmen. Extraheer een SAP-korrel met hyfen en sporen en plaats deze in de inkt bij RT. De inkt dringt door in de SAP-korrel en kleurt de schimmeldraden en sporen binnen enkele minuten. Verwijder de SAP-korrel en doe deze in mMS-1 voedingsoplossing of kraanwater. De inkt komt binnen 12 uur uit de korrel, maar de sporen en schimmeldraden blijven bevlekt. Druk de SAP-korrel tussen twee microscoopglaasjes om deze plat te maken voor fotografie en sporentelling. Observeer arbuscules.Haal een paar wortels uit het wortelcompartiment en beits met behulp van het inkt- en azijnprotocol volgens Vierheilig et al. (1998)15. Zorg ervoor dat u de wortels niet langer dan 2-3 minuten in de KOH-oplossing onderdompelt; Anders worden de wortels te kwetsbaar voor de volgende stappen en vallen ze uiteen in onbruikbaar puin. Selecteer onder een ontleedmicroscoop een wortelfragment van ongeveer 5 mm lang dat arbuscules kan bevatten en leg het op een objectglaasje in een druppel water. Scheur met acupunctuurnaalden of een extreem dun pincet de wortels af in lagen van een paar cellen dik. Absorbeer het water en controleer onder de microscoop of de segmenten met arbuscules nog aanwezig zijn en van voldoende kwaliteit zijn, en correct op het objectglaasje zijn geplaatst. Op dit punt moeten de arbuscules goed zichtbaar zijn in de wortelcellagen. Laat 2-3 minuten drogen zodat de wortellagen aan het glaasje hechten. Voeg een druppel polyvinylalcohol-melkzuurglycerol (PVLG)-buffer toe en voeg het dekglaasje toe. Observeer met standaard microscopiemethoden.