JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
환경과학

Посев и наблюдение культур арбускулярной микоризы на суперабсорбентных автотрофных системах на основе полимеров

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66848
, ,
1Centre d’Étude de la Forêt (CEF) and Institut de Biologie Intégrative et des Systèmes (IBIS),Université Laval, 2Ottawa Research and Development Centre, Agriculture and Agri-Food Canada

Summary

В данной статье мы опишем простую и недорогую методику инокуляции и наблюдения за арбускулярными микоризными грибами в суперабсорбирующих автотрофных системах на основе полимеров.

Abstract

Арбускулярные микоризные грибы (АМ) трудно манипулировать и наблюдать из-за их постоянной связи с корнями растений и распространения в ризосфере. Как правило, грибы AM культивируют в условиях in vivo в культуре горшка с автотрофным хозяином или в условиях in vitro с корнями, преобразованными Ri Transfer-DNA (гетеротрофным хозяином) в чашке Петри. Кроме того, выращивание грибов AM в горшечной культуре происходит в непрозрачной и нестерильной среде. В отличие от этого, культура in vitro предполагает размножение грибов AM в стерильной, прозрачной среде. Недавно была разработана суперабсорбционная автотрофная система на основе полимеров (SAP-AS), которая сочетает в себе преимущества обоих методов, избегая при этом их соответствующих ограничений (непрозрачность и гетеротрофность хозяина, стерильность). Здесь мы представляем подробный протокол для упрощения подготовки, инокуляции одиночных спор и наблюдения за грибами AM в SAP-AS. Модифицируя чашки Петри, стало возможным проведение фото- и видеонаблюдений с высоким разрешением на живых образцах, что было бы затруднительно или невозможно при использовании современных методов in vivo и in vitro .

Introduction

Арбускулярные микоризные (AM) грибы (Glomeromycotina) являются древними симбионтами корней растений (~500 млн лет 1,2), которые, возможно, сыграли важную роль в колонизации наземных почв трахеофитами. Эта длительная коэволюция между грибами AM и трахеофитами делает арбускулярную микоризу шедевром межцарственного мутуализма. Гифы грибов AM значительно увеличивают способность хозяина добывать питательные вещества из почвы3, включая перенос питательных веществ к новым хозяевам через микоризные сети4. Гифальная сеть улучшает структуру почвы, а выработка гломалина может уменьшить эрозию почвы5. Перенос части атмосферного углерода в корневой симбионт гриба увеличивает секвестрацию углерода в почве6. В целом, грибы аддитивного производства повышают устойчивость растений как к абиотическим, так и к биотическим стрессам и поэтому им уделяется значительное внимание в агроэкологии7. Действительно, дружественные к грибам методы управления сельским хозяйством AM обладают потенциалом для сокращения использования химических веществ для производства сельскохозяйственных культур и повышения содержания органического углерода в почве, что является важными целями, которые фермеры должны интегрировать в свою практику управления, чтобы соответствовать национальным и международным обязательствам по переходу к устойчивым методам ведения сельского хозяйства и борьбе с изменением климата.

Однако АМ-грибы являются почвенными микроскопическими грибами, и их изучение затруднено из-за их облигатной биотрофии и ризосферного распределения. Почва является одним из самых сложных биотопов для изучения из-за ее непрозрачности, огромного разнообразия ниш и многотрофических взаимодействий во всех масштабах. Поэтому выделение, размножение и характеристика грибов AM затруднены. До середины20-го века были охарактеризованы только виды грибов AM, образующие спорокарпы8. Тем не менее, большинство видов грибов AM производят неспорокарпические споры размером от ~20 мкм до ~500 мкм в диаметре. Описание метода влажного просеивания почвы9 открыло путь к описанию этих видов грибов АМ, и с тех пор скорость описания видов возросла. Тем не менее, грибы AM представляют собой небольшую группу видов по сравнению с Dikarya.

Ловушки-культуры, т.е. инокуляция спорами или образцом почвы окружающей среды, содержащим споры грибов АМ, из горшка, наполненного автоклавным материалом, таким как турфас и вермикулит, и стерилизованными семенами хозяина (лук-порей, подорожник), является одним из способов размножения грибов АМ в контролируемыхусловиях. Тем не менее, успех инокуляции можно оценить только путем поиска наличия арбускул в фрагментах корней после окрашивания или путем влажного просеивания подобразца или всего горшка для выделения спор. Обычно рекомендуется не беспокоить систему в течение как минимум 6-12 недель до анализа горшечной культуры. Этот метод культивирования подходит для размножения большинства известных видов грибов AM, но наблюдение за симбионтом гриба в реальном времени невозможно, и успех инокуляции неясен, особенно при попытке создания культур с отдельными спорами.

Напротив, размножение грибов AM in vitro можно контролировать в реальном времени благодаря прозрачности питательной среды11, но этот метод культивирования требует наличия трансформированных корней и присутствия углерода в питательной среде для работы в стерильной среде. Споры должны быть стерилизованы, и вместе с ассоциацией с гетеротрофным хозяином большинство известных видов грибов AM не могут быть успешно размножены с помощью этого метода.

Таким образом, размножение грибов АМ с использованием современных методов, хотя и установлено и широко используется в большинстве лабораторий, имеет некоторые ограничения для изучения грибов АМ. Paré et al. (2022)12 разработали метод in vivo с использованием прозрачного суперабсорбирующего полимера (SAP) в сочетании с целыми растениями для размножения грибов AM. Методика, разработанная в виде автотрофной системы на основе SAP (SAP-AS), проста и недорога и сочетает в себе преимущества горшечной культуры (ассоциация с автотрофным хозяином, нестерильные условия) и культур in vitro (прозрачная среда, мониторинг развития симбиоза в реальном времени). Здесь мы представляем протокол, объясняющий, как настраивать культуры с помощью инокуляции одиночных спор и использовать SAP-AS для наблюдения экстрарадикального мицелия с большим увеличением. В частности, мы описываем, как модифицировать двухкамерные чашки Петри, готовить питательный раствор, готовить суперабсорбирующий полимер (SAP), готовить рассаду, собирать SAP-AS и инокулировать одной спорой, проращивать споры и следить за развитием симбиоза в режиме реального времени.

Protocol

1. Модификация двухкамерных чашек Петри ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, необходимые для этого шага, перечислены в Таблице материалов. Модифицируйте крышку чашки Петри.С помощью вращающегося инструмента и соответствующего резьбового сверла просверлите два отверстия (~7 мм в диаметре) в верхней части крышки и отверстие сбоку на 1 см. Одно отверстие будет использоваться для орошения корневого (вермикулитового) отдела, а другое – для отделения гиф (SAP). Измените дно чашки Петри.Просверлите в боковой части дна чашки Петри выемку для стебля растения с помощью электрического поворотного инструмента. Убедитесь, что выемка не слишком глубокая, чтобы жидкость не стекала. Эта выемка совпадет с отверстием в крышке на 1 см (шаг 1.1). Чтобы заменить пластиковый барьер двухкамерной чашки Петри на фильтрующую мембрану из нейлоновой сетки, с помощью электрического вращающегося инструмента просверлите прямоугольную выемку диаметром 30 мм до дна чашки Петри. Для наблюдения с высоким разрешением просверлите круглые отверстия диаметром ~25 мм в дне чашки Петри. В зависимости от требований сделайте одно отверстие (или несколько отверстий) со стороны SAP или по одному в каждом отсеке. Следите за тем, чтобы отверстия не были просверлены непосредственно под отверстиями для полива крышки. Установите капроновую сетчатую фильтрующую мембрану.С помощью металлической направляющей и скрепки заклините кусок фильтрующей мембраны из нейлоновой сетки на месте и плотно прижмите его к пластиковому барьеру. Совместите верхнюю часть мембраны с верхней частью пластикового барьера. Убедитесь, что мембрана выступает из нижней части направляющей. С помощью набора для пирографии разрежьте по краю металлическую направляющую для расплавления и запечатайте мембрану до дна чашки Петри и пластикового барьера, разделяющего два отсека. Не снимая с себя металлическую направляющую и скрепку, осторожно удалите пинцетом излишки фильтрующей мембраны из нейлоновой сетки. Убедитесь под микроскопом, что фильтрующая мембрана из нейлоновой сетки правильно прилегает к пластику, чтобы предотвратить проникновение корней в гифальный (SAP) компартмент. Установите покровное стекло.ПРИМЕЧАНИЕ: Покровная крышка помещается под чашку Петри. Это позволяет использовать погружное масло и очищать покровное стекло.Поместите силиконовый герметик по краю круглых отверстий (снаружи дна чашки Петри). Поместите покровную крышку на внешнюю сторону дна чашки Петри и осторожно нажмите, чтобы обеспечить идеальную адгезию. Дайте высохнуть, и удалите излишки герметика лезвием бритвы. Осмотрите и очистите.С помощью воздушного потока удалите пыль или кусочки пластика, которые могли прилипнуть к чашке Петри. Осмотрите под препарирующим микроскопом, чтобы выявить и исправить любые дефекты.ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте перчатки, чтобы избежать отпечатков пальцев на чашках Петри 2. Приготовление 1 л питательного раствора мМС-1 Приготовьте исходные растворы.Макроэлементы: Взвесьте и растворите в 1 л дистиллированной воды:7,31 г MgSO4·7 H2O, 0,80 г KNO3, 0,65 г KCl и 0,048 г KH2PO4,. Вес 2,88 г Ca(NO3)2·4H2O и растворить в 1 л дистиллированной воды. Взвесьте 0,80 г NaFeEDTA и растворите в 0,5 л дистиллированной воды. Взвесьте 0,375 г KI и растворите в 0,5 л дистиллированной воды. МикронутриентыРастворите 3 г MnCl2·4H2O в 100 мл дистиллированной воды. Растворите 1,325 г ZnSO4·7Н2О в 100 мл дистиллированной воды. Растворите 0,75 г Н3БО3 в 100 мл дистиллированной воды. Когда растворятся, смешайте растворы, приготовленные на этапах 2.1.5.1-2.1.5.3. Вес 0,65 г CuSO4·5H2O и растворить в 50 мл дистиллированной воды. Растворить 0,12 г Na2MoO4·2H2O в 100 мл дистиллированной воды. Добавьте 5 мл раствора с шага 2.1.5.5 и 1 мл с шага 2.1.5.6 в раствор с шага 2.1.5.4. Объем раствора, полученного на шаге 2.1.5.7, отрегулируйте до 500 мл дистиллированной водой. Приготовьте 1 л среды mMS-1.Добавьте 700 мл дистиллированной воды в стеклянную бутылку объемом 2 л. Постоянно помешивая магнитным стержнем, добавьте 100 мл раствора макронутриентов (шаг 2.1.1), 100 мл раствора нитрата кальция (шаг 2.1.2), 5 мл раствора железа ЭДТА (шаг 2.1.3), 1 мл раствора KI (шаг 2.1.4) и 1 мл раствора микроэлементов (шаг 2.1.5). Отрегулируйте объем раствора до 1000 мл.Примечание: mMS-1 адаптирован из Bécard and Fortin (1988)14. Стерилизация при 121 °C в течение 15 минут не является обязательной, так как SAP-AS не является стерильным. pH не корректируется, потому что SAP обладает сильным буферным эффектом, а Paré et al. (2022)12 показали, что условия на SAP были относительно нейтральными (от 6,7 до 7,4). 3. Подготовка САП ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, необходимые для этого шага, перечислены в Таблице материалов. Hydrate SAP: смешайте 5 г сухого SAP с 500 мл раствора питательного вещества mMS-1 (шаг 2.2). Дайте воде в течение 12 часов (на ночь) при комнатной температуре (RT). Слейте воду и соберите гидратированные зерна SAP.Если гидратированный SAP используется для заполнения 12-луночного планшета (секция 7), не сливайте воду из гидратированного SAP и смешайте гидратированное зерно с остатками питательного раствора mMS-1.ПРИМЕЧАНИЕ: Доступны три гранулометрии сухой SAP: малая, средняя и большая. Наиболее подходящей является средняя гранулометрия (1-2 мм). СОК крупной гранулометрии при гидратации заглатывает слишком много, и крышка чашки Петри не может быть закрыта, в то время как СОП мелкой гранулометрии оставляет мало пространства между ними, что является ограничением для наблюдений за грибковой структурой между зернами. 4. Подготовка рассады ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, необходимые для этого шага, перечислены в Таблице материалов. Прорастить семена P. lanceolata на промокательной бумаге, смоченной в питательном растворе mMS-1, в чашке Петри. Инкубация в темноте на RT. При необходимости увлажняйте корешки, пока длина корешков не составит не менее 2 см. 5. Сборка и управление SAP-AS ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, необходимые для этого шага, перечислены в Таблице материалов. Сборка SAP-AS (шаг 1 + шаг 2 + шаг 3 + шаг 4)Поместите стебель саженца в выемку сбоку от чашки Петри корнем внутрь, а семядолями/листьями и стеблями наружу. Засыпьте корни примерно 1,5-2 г вермикулита. Увлажните корневое отделение 8 мл питательного раствора mMS-1. Это поможет стабилизировать корень и вермикулит. Добавьте 5 г гидратированного сока вдоль фильтрующей мембраны из капроновой сетки сбоку от корневого отдела. Добавьте 15 г гидратированного SAP в гифальный отсек. Гифальный отсек — это отсек без выемки на боковой стороне дна чашки Петри. Перед тем как закрыть чашку Петри крышкой, убедитесь, что боковые насечки крышки и дно чашки Петри выровнены, чтобы не повредить ножку. Запечатайте чашку Петри полоской парафина, которая соединяет основание и крышку, стараясь не раздавить молодой стебель. Взвесьте и запишите средний вес чашки Петри, чтобы определить, когда SAP-AS нуждается в регидратации. Сложите чашки Петри, чтобы оптимизировать пространство. Держите чашку Петри в темноте, используя непрозрачную крышку с отверстием сбоку для рассады. Управление SAP-AS.Увлажняйте чашки Петри только питательным раствором mMS-1. Используйте средний вес в качестве эталона. Когда чашка Петри осветлит на 5-6 г, добавьте питательный раствор mMS-1, чтобы вернуть ее к первоначальному весу. Следите за тем, чтобы вермикулит и SAP оставались гидратированными, но не затопленными. Корни должны иметь доступ к кислороду. По мере развития рассады и ее грибкового партнера орошайте их чаще. Не стоит поливать оба отсека одновременно. Требования к орошению варьируются в зависимости от развития рассады, а также в зависимости от условий окружающей среды, в которых инкубируются SAP-AS. Уменьшите потребность в поливе, удалив старые листья, если у растения более трех здоровых листьев. Удалите опавшие листья.Примечание: Присутствие катионов, таких как K+,Mg2+ иCa2+ в питательном растворе mMS-1, имеет тенденцию уменьшать расширение сети SAP13 с течением времени. 6. Модифицирование SAP-AS одной спорой ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, необходимые для этого шага, перечислены в Таблице материалов. Прививайте одной спорой.Нагрейте стеклянную пипетку с помощью пламенной свечи или горелки Бунзена. Потяните, пока стекло плавится, чтобы растянуть стеклянную трубку до тех пор, пока она не отделится. Под стереомикроскопом разломайте кончик стеклянной пипетки, чтобы уменьшить внутренний диаметр (обычно 100-300 мкм). Это значительно облегчит манипуляции с отдельными спорами. Откройте чашку Петри, найдите место, где должна быть помещена спора, и очистите пространство среди 5 г гидратированной смолы вдоль фильтрующей мембраны из нейлоновой сетки, чтобы обнажить участок корня. Под рассекающим микроскопом возьмите спору с помощью выдавленной пипетки. Пипетку с небольшим количеством жидкости перед пипетированием споры. Избегайте пипетирования жидкости после сбора спор. Под рассекающим микроскопом аккуратно отложите споры на корень. Жидкость, отпижеванная пипеткой перед пипетированием споры, поможет вывести споры. Если спора отложилась не в оптимальном месте, используйте акупунктурную иглу или щетку, чтобы вернуть спору в контакт с корнем. При необходимости сфотографируйте спору, отложившуюся на корне, для справки и с помощью маркера определите место прививки. Замените сок над фрагментом корня, чтобы обеспечить влажное микроокружение для корня и споры. Подождите не менее 24 часов, прежде чем орошать корневой отсек, и будьте осторожны, чтобы не смыть споры с корнем. Перед тем как закрыть чашку Петри крышкой, убедитесь, что боковые насечки крышки и дно чашки Петри выровнены так, чтобы не повредить стебель рассады.ПРИМЕЧАНИЕ: SAP-AS готов к инокуляции, когда корни достигают фильтрующей мембраны из нейлоновой сетки, в идеале через несколько дней после полива, поэтому свободной жидкости не остается. 7. Проращивание спор на SAP (опционально) ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, необходимые для этого шага, перечислены в Таблице материалов. Проращивание спор.Смешайте гидратированный СО, чтобы получить гладкую текстуру (см. шаг 3.3.1). Пузырьки воздуха обычно исчезают в течение 24 часов или путем автоклавирования (опционально) смешанного SAP. С помощью шприца объемом 20 мл без иглы пипеткой введите примерно 2 г (что эквивалентно 2 мл) смешанного SAP в каждую лунку 12-луночного планшета. Выберите спору под препарирующим микроскопом и используйте экструдированную пипетку, как описано в разделе 6. Под микроскопом для препарирования поместите спору в центр каждой лунки. Инкубируйте 12-луночный планшет в темноте при RT и периодически контролируйте всхожесть. Под рассекающим микроскопом выберите спору с растущей гифой (не менее нескольких миллиметров в длину). Добавьте в лунку 1 мл питательного раствора mMS-1 и подождите несколько минут, чтобы среда стала более жидкой. При необходимости с помощью акупунктурной иглы аккуратно удалите споры и гифы из субстрата. Соберите спору либо с помощью пипетки, либо поднеся корни саженца к поверхности среды, чтобы приклеить спору и гифы к корням. Затем поместите рассаду в чашку Петри, как описано в пункте 5.1.3.ПРИМЕЧАНИЕ: Координируйте прорастание спор и рост рассады. Этот метод был протестирован только на спорах R. irregularis . 8. Мониторинг развития симбиоза в режиме реального времени ПРИМЕЧАНИЕ: Материалы, необходимые для этого шага, перечислены в Таблице материалов. Регулярно наблюдайте с помощью препарирующего, вертикального или перевернутого микроскопа.Наблюдайте за верхней частью каждого отсека в 20–40 раз с помощью препарирующего микроскопа с белым освещением и темным полем. Если инвертированный микроскоп недоступен, осмотрите дно каждого отсека с помощью препарирующего или вертикального микроскопа, перевернув чашку Петри. Прежде чем переворачивать чашку Петри, дайте SAP-AS высохнуть в течение 2 дней, чтобы SAP слегка прилип ко дну чашки Петри. Проводите подробные наблюдения с 40-кратным погружением в дно чашки Петри и до 100-кратным (погружение в масло) через покровное стекло. Наблюдайте за спорами и гифальными сетями.ПРИМЕЧАНИЕ: Грибковые структуры, развивающиеся внутри зерен SAP, могут быть окрашены.Приготовьте раствор чернил и уксуса в соответствии с Vierheilig et al. (1998)15. Не нагревайте. Извлеките зерно SAP, содержащее гифы и споры, и поместите его в чернила при температуре RT. Чернила проникнут в зерно SAP и окрашивают гифы и споры в течение нескольких минут. Удалите зерно SAP и поместите его в питательный раствор mMS-1 или водопроводную воду. Чернила выйдут из зерна в течение 12 часов, но споры и гифы останутся окрашенными. Нажмите на зерно SAP между двумя предметными стеклами микроскопа, чтобы расплющить его для фотографирования и подсчета спор. Обратите внимание на арбускулы.Извлеките несколько корней из корневого отсека и покрасьте с помощью чернил и уксуса в соответствии с Vierheilig et al. (1998)15. Будьте осторожны, не погружайте корни в раствор КОН более чем на 2-3 минуты; В противном случае корни станут слишком хрупкими для последующих действий и распадутся на непригодный для использования мусор. Под препарирующим микроскопом выберите фрагмент корня длиной около 5 мм, который может содержать арбускулы, и поместите его на предметное стекло в каплю воды. С помощью акупунктурных игл или предельно тонкого пинцета оторвите корни слоями толщиной в несколько клеток. Впитайте воду и проверьте под микроскопом, чтобы сегменты с бускулами все еще присутствовали и удовлетворительного качества, и правильно размещены на предметном стекле. На этом этапе арбускулы должны быть хорошо заметны в слоях корневых клеток. Дайте подсохнуть 2-3 минуты, чтобы корневые слои прилипли к горке. Добавьте каплю буфера поливинилового спирта и молочной кислоты глицерина (PVLG) и добавьте покровную крышку. Наблюдайте стандартными методами микроскопии.

Representative Results

SAP-AS является простым и недорогим методом культивирования грибов AM и наблюдения за развитием внутрирадикальных и экстрарадикальных грибковых структур. Здесь мы предоставили подробный протокол, чтобы помочь пользователям настроить SAP-AS, и внесли две модификации по сравнению с исходным описанием SAP-AS. Во-первых, наличие SAP на корневом компартменте вдоль мембраны Nitex облегчает инокуляцию системы одной спорой (Рисунок 1). Рисунок 1: Инокуляция одной споры SAP-AS. (А) Инокуляция одной спорой Rhizophagus irregularis. (В) Инокуляция одной спорой Funneliformis mosseae. Белыми стрелками обозначена точка прививки. Масштабные линейки: 500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Легко определить участок с несколькими корнями, где могут отложиться споры. Точное местоположение спор может быть отмечено на поверхности крышки чашки Петри и периодически проверяться на прорастание и заселение корней. Наличие гидратированных зерен SAP обеспечивает влажную среду, способствующую прорастанию спор. Инокуляция на корнях рядом с мембраной Nitex позволяет быстро развить симбиоз с экстрарадикальным мицелием, чтобы быстро получить доступ к гифальному компартменту и получить питательные вещества (Рисунок 2). Возможность наблюдать, прорастает ли отдельная спора, помещенная в точку инокуляции, также позволяет нам выявлять и удалять неудачные культуры и заменять их. Во-вторых, покровные стекла на дне чашки Петри позволяют с высоким разрешением получать изображения симбиоза AM-гриба и гриба с высоким разрешением (рисунок 2B, C) и, в частности, цитоплазматического потока внутри экстрарадикального мицелия (рисунок 2D). Рисунок 2: Инокулированный SAP-AS. (A) SAP-AS инокулированный одной спорой Rhizophagus irregularis (DAOM 197198). Растением-хозяином является подорожник ланцетный. (В) Скопление спор, наблюдаемое через покровное стекло в гифальном отсеке под стереомикроскопом. Масштабная линейка: 500 мкм. (C) Фотография скопления спор с высоким разрешением, наблюдаемая через покровное стекло под световым микроскопом при 10-кратном увеличении. Масштабная линейка: 100 μм (D) Фотография гиф с высоким разрешением, наблюдаемая через покровное стекло под световым микроскопом при 100-кратном увеличении. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Пользователи могут попытаться прорастить споры грибов AM на SAP, гидратированном питательным раствором mMS-1, чтобы гарантировать, что SAP-AS инокулируются только жизнеспособными спорами (Рисунок 3). Тем не менее, это было проверено только на коммерческих спорах R. irregularis, и успех прорастания спор на SAP, гидратированном питательным раствором mMS-1, может значительно варьироваться с другими видами грибов AM. Рисунок 3: Проращивание спор R. irregularis в 12-луночном планшете. Масштабная линейка: 500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Наконец, поскольку SAP-AS является нестерильным методом размножения AMF in vivo, чашкой Петри можно манипулировать на стенде и открывать ее для отбора образцов колонизированных корней, свободных спор или колонизированных зерен SAP (рис. 4). Внутрирадикальные и экстрарадикальные грибковые структуры могут быть окрашены таким же образом, как и AMF, размножаемые в культурах горшков или корневых органов (рис. 4C). Рисунок 4: Экстрарадикальные и внутрирадикальные грибковые структуры AM, выделенные из SAP-AS. (A) Свободные споры R. irregularis наблюдаются в корневом компартменте. Масштабная линейка: 200 мкм. (B) Споры R. irregularis , окрашенные в SAP. Масштабная линейка: 500 мкм. (C) Окрашенные фрагменты корня, показывающие внутрирадикальные гифы и арбукулы. Масштабные линейки: 50 μм, 100 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный рисунок 1: Сравнение толщины различных инструментов, доступных для манипулирования спорами грибов AM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 2: Штабелированный SAP-AS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Инокуляция является наиболее важным этапом в протоколе, и пипетки Пастера из экструдированного стекла оказались отличным инструментом для точного манипулирования отдельными спорами грибов аддитивного производства, сохраняя при этом их целостность. Пипетки Пастера из экструдированного стекла легко придают форму с помощью пламени свечи или горелки Бунзена, а отверстие можно отрегулировать под стереомикроскопом в соответствии с размером пипетируемой споры. Важно манипулировать спорами с помощью инструментов, адаптированных к размеру спор гриба AM (дополнительный рисунок 1), и вводить SAP-AS, когда корни растения-хозяина достаточно длинные, чтобы достичь мембраны Nitex, где откладывается спора.

SAP-AS легко адаптируются к требованиям эксперимента. Большие чашки Петри с несколькими отсеками могут использоваться для мониторинга, например, взаимодействия между близкородственными штаммами или между различными видами AMF или для изменения химической (pH) или биологической среды (внедрение нематод, бактерий, грибков). Различные микотрофные растения-хозяева также могут быть использованы для обеспечения грибов AM фотосинтезом. Питательный раствор mMS-1 был получен из минимального (M) среднего рецепта, описанного Bécard and Fortin (1988)15 , за вычетом сахарозы, витаминов и бакто-агара для ограничения источников углерода. Тем не менее, SAP-AS может быть дополнен различными питательными растворами, в зависимости от целей эксперимента.

Размножение грибов АМ в САП-АС требует регулярного полива. Ограниченный объем вермикулита и SAP подвергает корни и гриб AM колебаниям влажности, особенно в стандартных двухкамерных чашках Петри (диаметр 10 см). Способность к расширению и, следовательно, прозрачность зерен SAP со временем снижается. Фактически, присутствие катионов из питательного раствора постепенно ограничивает расширение акрилатной сети и требует замены SAP через несколько месяцев. Кроме того, со временем могут разрастаться зеленые водоросли и плесень, если чашки Петри не защищены должным образом от света или переувлажнены.

На сегодняшний день в SAP-AS успешно культивируются семь видов грибов AM, что намного ниже количества видов грибов AM, которые могут быть размножены в горшечных культурах. Тем не менее, как биотические, так и абиотические условия в SAP-AS очень похожи на таковые в горшечных культурах, и вполне вероятно, что другие виды грибов AM должны иметь возможность размножаться в SAP-AS. Прямая инокуляция спор в SAP-AS, вероятно, создает условия окружающей среды, приближенные к ризосфере в естественной почве из-за присутствия корневых выделений и/или бактерий, если для инокуляции используются нестерильные споры/семена. Этому следует отдать предпочтение перед инокуляцией пророщенными спорами. Кроме того, условия, которые запускают прорастание спор в AMF, до сих пор плохо изучены, поэтому SAP, гидратированный питательным раствором mMS-1, может быть не адаптирован к прорастанию спор других видов грибов AM. Проращивание спор на SAP, гидратированном питательным раствором mMS-1, было протестировано для отбора жизнеспособных спор для этапа инокуляции с использованием только инокулята R. irregularis .

Посев и мониторинг развития симбиоза АМ легко выполняются в SAP-AS. Модифицированные двухкамерные чашки Петри позволяют выращивать различные виды грибов AM. Paré et al.12 размножили семь различных видов AMF из шести родов и трех семейств. Модификация двухкамерных чашек Петри легко производится с помощью недорогих инструментов. Стоимость и количество материалов (вермикулит, SAP, пипетка Пастера и т. д.) и реагентов (mMS-1), необходимых для приготовления и обслуживания SAP-AS, ограничены, что позволяет управлять большим количеством SAP-AS с минимальными затратами. Возможность штабелирования SAP-AS также значительно снижает занимаемую площадь грибных культур аддитивного производства по сравнению с горшечными культурами. Например, 50 SAP-AS (5 стопок по десять) могут поместиться на полке длиной 1 м (дополнительный рисунок 2). Эти особенности делают SAP-AS простым и недорогим методом, совместимым с обучением симбиозу аддитивного производства в лабораторных курсах средней школы или на уровне бакалавриата в университетах. Колонизированные зерна SAP могут быть использованы для инокуляции новых SAP-AS или горшечных культур.

Наличие покровного стекла в задней части дна чашки Петри позволяет фотографировать и снимать на видео экстрарадикальные грибковые структуры с высоким разрешением. Цитоплазматический поток может быть легко изучен в условиях жизни, очень приближенных к естественным. Это имеет большое значение для изучения функций грибов АМ, связанных с их мицелием (питательные вещества, водотранспорт, структура почвы и т.д.), а также для изучения морфогенеза гиф.

АМФ завершают свой биологический цикл в корнях растений и в ризосфере. Изучение почвенных микроорганизмов является сложным процессом из-за присущей ему сложности наблюдения за почвенной средой. Основной задачей SAP-AS является воссоздание среды, максимально похожей на ризосферу для размножения AM-грибов, сохраняя при этом возможность наблюдать за развитием AM-грибов в мельчайших подробностях. Поскольку это подразумевает нестерильные условия, количество доступного углерода должно быть ограничено, чтобы избежать размножения сапротрофных микроорганизмов. Знания о поведении грибов AM в ризосфере все еще крайне ограничены, и SAP-AS дает возможность проводить детальные сравнения между видами в отношении их способности добывать пищу в экстрарадикальной среде, производства спор и колонизации корней. Это может быть еще больше усложнено путем добавления взаимодействий с другими видами почв, такими как бактерии, нематоды, протисты и корневые грибковые патогены, а знания о взаимодействии почвенной микробиоты могут быть улучшены благодаря SAP-AS.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить двух анонимных рецензентов за их предложения. Финансирование этого исследования было предоставлено Министерством сельского хозяйства и продовольствия Канады (AAFC) в рамках проекта J-002295 (Управление и улучшение биологических коллекций AAFC).

Materials

100 x 15 mm Stackable Bi-Plate Kord Valmark 1204U09 https://www.thomassci.com/Laboratory-Supplies/Petri-Dishes/_/100-x-15-mm-Stackable-Bi-Plate
12-well plate  Greiner Bio-one 665180 https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/cell-culture-products/cellstar-cell-culture-multiwell-plates/665180.html
18 mm round glass coverslips Fisher Scientific 12-545-100 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-cover-glasses-circles-11/12545100#?keyword=12-545-100
20 mL Syringe PP/PE without needle Millipore Sigma Z683620-100EA https://www.sigmaaldrich.com/CA/en/product/aldrich/z683620?utm_source=google&utm_medium=
cpc&utm_campaign=20674735406
&utm_content=157607444391&gc
lid=Cj0KCQiA5rGuBhCnARIsAN11
vgQOT_WPRg9WFyBEyoO4b0x1
-F7Tks4houU7VTRS5EiYM9l0F-B
oL7saAmFoEALw_wcB
Acupuncture needle  Lierre A143-LP1-3075 https://www.lierre.ca/products/lierre-plus-acupuncture-needles-100pcs?gad
_source=1&gclid=Cj0KCQiA5rGuBh
CnARIsAN11vgTwupmw51UTdR
k9cKr4ewi12W3dyVikenzH3sjdUB4
g41G-_KnvppoaAkbTEALw_wcB&
utm_campaign=PMax-needles&utm_content=shopify_CA_
5213169090694_35001500991622
&utm_medium=cpc&utm_source=
google&variant=35001500991622
Blotting paper FLINN  FB0678 https://www.flinnsci.ca/blotting-paper-12-x-19-pkg.-of-10/fb0678/
Commercial or scientific blender or kitchen hand blender kitchenaid KHBV53DG https://www.kitchenaid.ca/en_ca/countertop-appliances/hand-blenders/hand-blender-products/p.variable-speed-corded-hand-blender.khbv53dg.html 
Dremel 199 Carving Bit Dremel 2615000199 https://www.dremel.com/ca/en/p/199-2615000199
Dry SAP medium granulometry 1–2 mm HORTA-SORB MD 00810085242789 https://www.horticulturalalliance.com/product/horta-sorb-md-granule/
Feather Stainless-Steel Blades for Dissecting Knife Handles  Fisher Scientific 08-916-5B https://www.fishersci.ca/shop/products/graham-field-stainless-steel-blades-dissecting-knife-handles-8/089165b
Glass Pasteur pipettes 230 mm Kimble RK-25554-14 https://www.coleparmer.ca/i/dwk-life-sciences-kimble-disposable-pasteur-pipettes-plugged-end-borosilicate-glass-230-mm-1000-cs/2555414
Ink Sheaffer 94321 https://www.amazon.com/Sheaffer-Skrip-Bottled-Black-94231/dp/B002IKKKUU
Melting guide: modified paint Scraper, 2-in Mastercraft #049-7335-8 https://www.canadiantire.ca/en/pdp/mastercraft-carbon-steel-flexible-spackling-putty-knife-wall-paint-scraper-2-in-0497335p.0497335.html?loc=plp
Microscopy glass slide Fisher Scientific 12-552-5 https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-frosted-microscope-slides-4/125525
Nitex nylon mesh filter screen  Dynamic Aqua-Supply Ltd. NTX30-108 https://dynamicaquasupply.com/products/nitex-screen?_pos=1&_sid=ffc105328&_ss=r&
variant=6945749106731
Paper clip Makanu ‎Clips-BK-41mm-24 https://www.amazon.ca/classeur-standard-grandes-trombones-excellentes
Parafilm Avantor/vwr 470201-930 https://www.avantorsciences.com/ca/en/product/8882964/parafilm
Plantago lanceolata seeds ecoumene NA https://www.ecoumene.com/produit/semences/herbacees/plantain-lanceole-bio/
Polyvinyl alcohol-lactic acid-glycerol (PVLG). NA NA https://invam.ku.edu/recipes
Pyrography kit with fine tip Walnut Hollow 483103 https://www.walnuthollow.com/collections/creative-wood-burning/products/walnut-hollow-creative-versa-tool
Silicone sealant Aqueon 100165003 https://www.aqueon.com/products/aquariums/silicone-sealant
Surgeon scalpel handle Fisher Scientific 22-079657 https://www.fishersci.ca/shop/products/surgical-design-scalpel-handles-blades/22079657#?keyword=scalpel
Two Speed Rotary Tool Kit Dremel 200-1/21 https://www.dremel.com/ca/en/p/200-1-21-f0130200ah
Vermiculite PRO-MIX 4981110 https://www.canadiantire.ca/fr/pdp/vermiculite-pro-mix-9-l-0597936p.0597936.html
X1000 Round Coverslip dia. 30 mm #1 (0.13–0.16 mm) Fisher Scientific 12164692 https://www.fishersci.fi/shop/products/x1000-cover-slip-diam-30-mm-n-1-1/12164692
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dotzler, N., Krings, M., Taylor, T. N., Agerer, R. Germination shields in Scutellospora (Glomeromycota: Diversisporales, Gigasporaceae) from the 400 million-year-old Rhynie chert. Mycol Prog. 5 (3), 178-184 (2006).
  2. Redecker, D. Glomalean fungi from the ordovician. Science. 289 (5486), 1920-1921 (2000).
  3. Olsson, P. A., Jakobsen, I., Wallander, H. . Foraging and Resource Allocation Strategies of Mycorrhizal Fungi in a Patchy Environment. Mycorrhizal Ecology. Ecological Studies. , (2003).
  4. Zheng, C., Chai, M., Jiang, S., Zhang, S., Christie, P., Zhang, J. Foraging capability of extraradical mycelium of arbuscular mycorrhizal fungi to soil phosphorus patches and evidence of carry-over effect on new host plant. Plant Soil. 387 (1-2), 201-217 (2015).
  5. Singh, A. K., et al. The role of glomalin in mitigation of multiple soil degradation problems. Crit Rev Environ Sci Technol. 52 (9), 1604-1638 (2022).
  6. Wilson, G. W. T., Rice, C. W., Rillig, M. C., Springer, A., Hartnett, D. C. Soil aggregation and carbon sequestration are tightly correlated with the abundance of arbuscular mycorrhizal fungi: results from long-term field experiments. Ecol Lett. 12 (5), 452-461 (2009).
  7. Gianinazzi, S., Gollotte, A., Binet, M. -. N., van Tuinen, D., Redecker, D., Wipf, D. Agroecology: the key role of arbuscular mycorrhizas in ecosystem services. Mycorrhiza. 20 (8), 519-530 (2010).
  8. Stürmer, S. L. A history of the taxonomy and systematics of arbuscular mycorrhizal fungi belonging to the phylum Glomeromycota. Mycorrhiza. 22 (4), 247-258 (2012).
  9. Gerdemann, J. W., Nicolson, T. H. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Trans Br Mycol Soc. 46 (2), 235-244 (1963).
  10. Walker, C., Vestberg, M. A simple and inexpensive method for producing and maintaining closed pot cultures of arbuscular mycorrhizal fungi. Agr Sci Finland. 3, 233-240 (1994).
  11. Fortin, J. A., et al. Arbuscular mycorrhiza on root-organ cultures. Can J Bot. 80 (1), 1-20 (2002).
  12. Paré, L., Banchini, C., Hamel, C., Bernier, L., Stefani, F. A simple and low-cost technique to initiate single-spore cultures of arbuscular mycorrhizal fungi using a superabsorbent polymer. Symbiosis. 88, 61-73 (2022).
  13. Saha, A., Sekharan, S., Manna, U. Superabsorbent hydrogel (SAH) as a soil amendment for drought management: A review. Soil Tillage Res. 204, 104736 (2020).
  14. Bécard, G., Fortin, J. A. Early events of vesicular-arbuscular mycorrhiza formation on Ri T-DNA transformed roots. New Phytol. 108 (2), 211-218 (1988).
  15. Vierheilig, H., Coughlan, A. P., Wyss, U., Piché, Y. Ink and vinegar, a simple staining technique for arbuscular-mycorrhizal fungi. Appl Environ Microbiol. 64 (12), 5004-5007 (1998).

Tags

Arbuscular Mycorrhizal FungiAM FungiSuperabsorbent PolymerAutotrophic SystemIn Vitro CultureIn Vivo CultureRi T-DNA Transformed RootsPot CultureRhizosphereInoculationObservationMicroscopy

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Paré, L., Banchini, C., Stefani, F. Inoculating and Observing Arbuscular Mycorrhizal Cultures on Superabsorbent Polymer-Based Autotrophic Systems. J. Vis. Exp. (208), e66848, doi:10.3791/66848 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image