JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

Модифицированная перфузия Лангендорфа для увеличения времени перфузии сердечных трансплантатов грызунов

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66815
, , , , , ,
1Center for Engineering in Medicine and Surgery,Harvard Medical School and Massachusetts General Hospital, 2Shriners Children’s Boston, 3Division of Cardiac Surgery, Corrigan Minehan Heart Center,Massachusetts General Hospital

Summary

В данной статье демонстрируется возможность достижения более длительного времени перфузии (4 ч) мышиных сердечных трансплантатов без потери функции за счет использования более низкого (30-35 мм рт.ст.), чем физиологического (60-80 мм рт.ст.) перфузионного давления во время Лангендорфа.

Abstract

Несмотря на важные достижения в диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ), эта область остро нуждается в расширении исследований и научного прогресса. В результате, инновации, усовершенствования и/или перепрофилирование имеющегося набора исследовательских инструментов могут обеспечить улучшенные испытательные стенды для продвижения исследований. Перфузия Лангендорфа является чрезвычайно ценным методом исследования в области исследований сердечно-сосудистых заболеваний, который может быть модифицирован для удовлетворения широкого спектра экспериментальных потребностей. Такая адаптация может быть достигнута путем персонализации большого количества параметров перфузии, включая давление перфузии, расход, перфузат, температуру и т. д. Этот протокол демонстрирует универсальность перфузии Лангендорфа и возможность достижения более длительного времени перфузии (4 ч) без потери функции трансплантата за счет использования более низкого давления перфузии (30-35 мм рт.ст.). Достижение увеличенного времени перфузии без повреждения трансплантата и/или потери функции, вызванной самим методом, может устранить искажающие элементы из экспериментальных результатов. В действительности, в научных условиях, когда более длительное время перфузии имеет отношение к экспериментальным потребностям (т.е. лечение лекарствами, анализ иммунологического ответа, редактирование генов, сохранение трансплантата и т.д.), более низкое давление перфузии может быть ключом к научному успеху.

Introduction

В области сердечно-сосудистых исследований были достигнуты важные успехи в диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). Однако, несмотря на общее снижение заболеваемости и смертности, ССЗ остаются ведущей причиной смертности во всем мире 1,2. Этот тревожный факт подчеркивает необходимость активизации исследований и научного прогресса, который, несомненно, зависит от точности и предсказуемости имеющихся исследовательских инструментов. В результате возникает постоянная потребность в инновациях, совершенствовании и/или перепрофилировании исследовательского инструментария. Например, ретроградная перфузия сердца или перфузия сердца Лангендорфа, метод, доступный в этой области более века, может быть легко модифицирован для покрытия более широкого круга научных потребностей и достижения более широкого спектра применений.

Изоляция сердечного трансплантата от остального организма во время перфузии Лангендорфа обеспечивает важную степень контроля над широким спектром экспериментальных параметров, включая температуру, циркулирующий раствор, давление коронарной перфузии и т.д.3,4,5,6,7. Манипулирование этими параметрами облегчает моделирование большого числа кардиологических сценариев, которые могут быть использованы для дальнейшего научного прогресса 5,8,9,10. Среди этих параметров давление перфузии, вероятно, является наиболее упускаемым из виду экспериментальным параметром11.

Во время синдрома Лангендорфа перфузионное давление демонстрирует прямую корреляцию с частотой сердечных сокращений, пиковым систолическим/диастолическим давлением и потреблением кислорода11. Эта корреляция обеспечивает прямой и точный контроль над объемом работы, производимой сердечными трансплантатами, которые могут быть скорректированы в соответствии с индивидуальными экспериментальными потребностями. Несмотря на эту ценную возможность контроля, исторически сложилось так, что отрасль тяготела к использованию более высоких перфузионных давлений (60-80 мм рт.ст.), подвергая все сердечные трансплантаты высокой рабочей нагрузке, независимоот экспериментальных потребностей. Последствия этого неоправданно высокого спроса на работу вытекают из всеобъемлющего принципа, согласно которому переработка имеет тенденцию приводить к преждевременному выходу из строя. Это, по-видимому, особенно верно для сердечных трансплантатов, перфузированных с помощью Лангендорфа, поскольку нефизиологичность этого метода и отсутствие поддержки восстановления, присутствующей in vivo, по-видимому, усугубляют отторжение трансплантата. Эта преждевременная потеря функции трансплантата значительно ограничивает время перфузии и эксперимента. В действительности, в обстоятельствах, когда более длительное время перфузии более актуально для экспериментальных потребностей (т.е. медикаментозное лечение, анализ иммунологического ответа, редактирование генов, сохранение трансплантата и т.д.), более низкая сердечная нагрузка может быть оправдана в обмен на повышенную долговечность трансплантата.

Этот протокол демонстрирует возможность использования более низких перфузионных давлений (30-35 мм рт.ст.) во время Лангендорфа, а также значительное влияние, которое они оказывают на функцию сердечного трансплантата с течением времени по сравнению с более высокими перфузионными давлениями (60-80 мм рт.ст.). Кроме того, результаты, представленные в этой рукописи, подчеркивают важность приоритизации настройки широкого спектра параметров перфузии для лучшего удовлетворения экспериментальных потребностей.

Protocol

Это исследование проводится в соответствии с рекомендациями Комитета по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Массачусетской больницы общего профиля. 1. Проектирование системы Соберите систему из трех компонентов с двойной оболочкой, включая пузырьковую ловушку, резервуар, оксигенатор, перистальтический насос и циркуляцию воды. Прикрепите все компоненты с оболочкой к одной стойке для зажимов. Соедините компоненты последовательно с помощью силиконовых трубок в двух разных последовательностях (рисунок 1A).Последовательность 1 – Схема протекания воды через рубашку (сплошные линии на рисунке 1А):Подсоедините выпускной патрубок циркуляционного насоса к нижнему входному отверстию рубашки пузырьковой ловушки с помощью трубки 36 G. Это гарантирует, что перфузат будет поддерживаться при правильной температуре (37 °C) до того, как достигнет сердца, так как вода будет терять тепло при прохождении через другие компоненты системы. Соедините верхнее входное отверстие рубашки пузырьковой ловушки с нижним входным отверстием рубашки резервуара с помощью трубки того же размера. Затем соедините верхнее входное отверстие рубашки резервуара с нижним входным отверстием рубашки оксигенатора. Наконец, подсоедините верхнее входное отверстие оксигенатора к входу циркуляционного насоса воды. Последовательность 2 – Схема течения перфузата через систему (пунктирные линии на рисунке 1А)Прикрепите разъемы Люэра к обеим сторонам трубки 16 G. Прикрепите первый конец к основанию резервуара и пропустите его через перистальтическую головку насоса. Подсоедините другой конец к одному из входных отверстий силиконовой спирали в оксигенаторе. Подсоедините второй кусок трубки 16 G, оснащенный разъемами люэровского замка на обоих концах, на втором входе силиконовой спирали оксигенатора к входу в пузырьковую ловушку с длинным выступом. Подсоедините более короткий отрезок трубки 16 G, оснащенный люэровскими соединителями, к неиспользуемому выходу пузырьковой ловушки к трехходовому люэровскому запорному клапану. На противоположной стороне трехходового клапана подсоедините кусок трубки 16 G со вторым клапаном Люэра на другом конце. Этот второй клапан находится непосредственно над резервуаром. Подсоедините противоположную сторону клапана к трубке 16 G, а затем к датчику давления. Подсоедините трубку меньшего диаметра ( ̃3,7 мм) к вертикальному отверстию трехходового клапана с коннектором к канюле (ангиокат 14 G). Перфузат поступает из резервуара в оксигенатор через пузырьковую ловушку, а затем возвращается обратно в резервуар через соединение аортальной канюли. 2. Приготовление перфузата Приготовьте базовый перфузат, 0,96% буфер Кребса-Хенселеита, 9,915 мМ декстрана, 25 мМ бикарбоната натрия, 1,054 мМ бычьего сывороточного альбумина, 1% стрептококка, 0,13% инсулина, 0,02% гидрокортизона, 0,5% гепарина и 2,75 мМ хлорида кальция и доведите до объема с дистиллированной водой. 3. Настройка перфузионной системы Подсоедините два шприца объемом 10 мл к верхнему и боковым вентиляционным отверстиям на пузырьковой ловушке. Добавьте в резервуар базовый перфузат (75 мл). Включите перистальтический насос и установите циркуляционный насос воды на 37 °C. Подсоедините кислородную линию (95%O2 и 5%CO2) к третьему входу в оксигенатор и насытьте перфузат кислородом до минимальногоpO2 400 мм рт.ст. Закрепите отверстие впрыска на вертикальном отверстии трехходового клапана сразу за ловушкой для пузырьков. Подсоедините крылатую инфузионную иглу со шприцем объемом 1 мл к порту для инъекций (используется для забора). Осторожно постучите по отверстию инъекции или наберите перфузат с помощью шприца объемом 1 мл, чтобы удалить пузырьки, попавшие в цепь. После того, как перфузат основания нагреется до уровня кислорода, выполните первоначальное считывание биохимических параметров, чтобы обеспечить правильную концентрацию ионов (Таблица 1) и надлежащее насыщение кислородом.ПРИМЕЧАНИЕ: Уровни ионов и pH должны быть измерены после того, как раствор был доведен до температуры (37 °C) и насыщен кислородом соответствующей газовой смесью (95%O2, 5% CO2). Обнулите датчик давления, разжав подключенную трубку, и дайте потоку перфузата через открытый датчик и канюлю уравновеситься. После балансировки нажмите кнопку «ноль» в блоке датчика и снова зажмите трубку. Записывайте базовое давление до присоединения сердца к системе для потоков в диапазоне от 1 мл/мин до 15 мл/мин. Перфузия низкого давленияКапельница с аденозином: Сделайте первоначальный запас аденозина в 20 мМ в базовом перфузате. Растворите аденозин, поместив трубку на водяную баню с теплой водой и перемешав путем инверсии. Разведите исходный аденозин до концентрации 0,06 мг/мл в базовом перфузате и добавьте его в шприц объемом 50 мл. Прикрепите крыльчатую инфузионную иглу к шприцу объемом 50 мл и подсоедините ее к порту для инъекций в трехходовом клапане. Закрепите шприц на шприцевом насосе и установите скорость инфузии 166,6 мкл/мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Пузырьки выпускаются из инфузионного порта при легком постукивании или щелчке по порту. Перфузия под высоким давлением:Выделение упакованных эритроцитов (pRBCs):Соберите 10-12 мл цельной крови крысы с помощью пункции сердца крысы-донора. Центрифугируйте кровь при 2000 х г в течение 10 минут. Удалите плазму и слой охристого слоя с помощью пипетирования. Ресуспендировать пэритроциты в перфузате без хлорида кальция в соотношении 1:1 (например, 5 мл пэритроцитов: 5 мл перфузата) путем инверсионного перемешивания. Повторите шаги 3.8.1.2-3.8.1.4 дважды, всего 3 стирки. После последней промывки ресуспендируйте клетки в перфузате в соотношении 1:1 и добавьте смесь в перфузионную систему, уже содержащую 75 мл базового перфузата. Дайте клеткам равномерно распределиться по системе и измерьте гематокрит перфузата с помощью гематологического аппарата. Гематокрит колеблется в пределах 5-7%. 4. Подготовка к забору сердечного трансплантата Полностью загрунтуйте перфузионную систему перед началом заготовки, чтобы свести к минимуму время холодной ишемии. Подготовьте хирургические инструменты. Хирургические инструменты включают синие подушечки, хирургическую ленту, шелковые шовные нити 5-0, ватные палочки, шприцы с физраствором (50 мл и 10 мл), операционные ножницы, щипцы, микроножницы, микрощипцы, зажим Холстеда, 30 U гепарина, трубку 16 G для промывки портала, трубку 14 G для канюляции сердца, ангиокат 16 G, модифицированную ангиокату 14 G с манжетой, датчик давления, ведро со льдом, чашка Петри 47 мм, марля. Создайте модифицированную канюлю, вставив тонкое кольцо трубки (внутренний диаметр [ID] 0,167 мм, внешний диаметр [OD] 2,42 мм) на канюлю 14 G, создав эффект манжеты.Снимите иглу канюли и добавьте каплю суперклея ниже кольца. Осторожно сдвиньте кольцо на 1/4 дюйма над основанием канюли. Перед использованием дайте клею высохнуть. Разрежьте канюлю как можно ближе к манжете под углом и удалите острые края. Наполните шприц объемом 60 мл гепаринизированным физиологическим раствором (0,03 Ед/мл) для промывания воротной вены. Подсоедините шприц к датчику давления, а затем к промывочной трубке 16 G. Подсоедините шприц объемом 10 мл гепаринизированного физиологического раствора (0,03 Ед/мл) к трубке 14 G. Подсоедините другой конец трубки к канюле аорты и промойте, чтобы удалить пузырьки воздуха. Поместите аортальную канюлю в чашку Петри диаметром 47 мм с марлей и наполните ее физиологическим раствором. Оставьте чашку Петри на льду до тех пор, пока сердце не будет подключено к системе перфузии. 5. Заготовка сердечного трансплантата Обезболить крыс в анестезиологической камере 3% изофлураном. Если рефлексы не замечены, извлеките крысу из камеры, поместите ее в операционное пространство и непрерывно подавайте изофлуран (3%) через маску для лица. После теста с защемлением пальца ноги гепаринизировать животное через вену полового члена 30 ЕД гепарина. Побрейте крысу по всему животу и верхней части грудной клетки. Удалите шерстяную стружку с операционного поля. Заклейте каждую конечность лентой, чтобы не двигаться во время операции. Сделайте горизонтальный разрез по средней линии на коже нижней части живота, обнажая мышцы живота. Сделайте второй горизонтальный разрез по средней линии в мышцах живота, обнажая внутренние органы. Обнажите грудину, закрепите ее гемостатом и втяните краниально, чтобы обнажить печень и воротную вену. Канюляция воротной вены с помощью ангиокат 16-го калибра. Приложите шприц объемом 60 мл гепаринизированного физиологического раствора к ангиокате и сделайте разрез в нижней полой вене и брюшной аорте для вентиляции. Промойте полное количество физиологического раствора через воротную вену.ПРИМЕЧАНИЕ: Давление промывки должно оставаться на уровне около 10 мм рт.ст. Сделайте горизонтальный разрез в диафрагме, а затем проксимальный разрез через ребра по обе стороны грудины, чтобы открыть грудную полость. Извлеките сердце из полости и сразу же поместите его на чашку Петри с физраствором на льду. Определите дугу аорты, зажмите ее с помощью гемостатиков и обнажите нисходящую аорту, очистив остатки соединительной ткани. Сделайте горизонтальный разрез на полпути через нисходящую аорту и канюлейте с помощью ангиокаты 14 G.ПРИМЕЧАНИЕ: Не прокалывайте аортальный клапан канюлей. Закрепите канюлю с помощью шва над манжетой и освободите гемостат. Дайте сердцу оставаться на льду до тех пор, пока оно не будет помещено в систему перфузии. 6. Инициация перфузии Установите расход перистальтического насоса на 1,0 мл/мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Канюля аорты всегда обрабатывается под углом 90° по отношению к сердцу, чтобы избежать введения пузырьков в коронарные артерии (Рисунок 1B). Взвесьте сердце с помощью канюли, прежде чем прикреплять сердце к системе.ПРИМЕЧАНИЕ: Канюля аорты должна быть полностью свободна от пузырьков воздуха. Подсоедините канюлю к разъему в системе и запустите таймер. Как только сердце полностью сократится, увеличьте кровоток с шагом 0,2 мл/мин, внимательно следя за давлением. Остановка увеличивает расход при достижении желаемого давления или до тех пор, пока не будет достигнуто минимальное значение 3,5 мл/мин.Перфузия низкого давленияДля давления в пределах 30-35 мм рт.ст. используйте расход 4,5 мл/мин. Запустите аденозиновый шприцевой насос. Перфузия под высоким давлениемДля давления в диапазоне 70-80 мм рт.ст. используйте минимальный расход 5,0 мл/мин. Запустите аденозиновый шприцевой насос. 7. Внутрижелудочковый баллон: Прикрепите небольшой латексный баллон (50 μл) к баллонному катетеру (диаметр 2 мм, длина 15 см) с коническим наконечником (диаметр 1,4 мм). Подключите катетер к датчику давления с помощью разъема замка Люэра и закрепите всю установку на зажимной стойке. Наполните баллон/катетер/датчик давления примерно 200 μл физиологического раствора с помощью шприца, прикрепленного к верхнему концу датчика давления, и удалите пузырьки изнутри датчика, катетера и баллона. Откалибруйте датчик давления с помощью сфигмометра. Сделайте небольшой горизонтальный надрез над левым предсердием. Сдуйте баллон, вытащив шприц в верхней части датчика давления и вставив его в левый желудочек. Инициируйте сбор данных и надувайте баллон до тех пор, пока диастолическое давление не достигнет 0 мм рт.ст. 8. Отбор проб Измеряйте частоту сердечных сокращений, кровоток в аорте и коронарное давление после первых 20 минут перфузии и каждый последующий час. 9. Окончание/очистка По окончании перфузии извлеките сердце из системы и взвесьте его для оценки отека. Разрежьте верхушку сердца с помощью кругового разреза и мгновенно заморозьте в жидком азоте для анализа после перфузии. Разрежьте окружной кусок сердца для гистологической визуализации и окрашивания. Утилизируйте остальную часть сердца и канюлю. Промойте все компоненты системы, добавив большое количество деионизированной (DI) воды в резервуар и запустив перистальтический насос. Наберите воду во внешнее ведро. Повторите шаг 9.4 два-три раза. Тщательно промойте все отверстия для отбора проб и трубки датчика давления. Наполните резервуар 600 мл деионизионной воды и 3 мл лабораторного моющего насоса по всей системе. Выключите водонагреватель, кислородный баллон и перистальтический насос.

Representative Results

Сердца взрослых самцов крыс породы Льюис (250-300 г массы тела) собирали и перфузировали при высоком (70-80 мм рт. ст.) или низком (30-35 мм рт. ст.) перфузионном давлении (n = 3 на группу). Влияние перфузионного давления на общую сердечную функцию и здоровье определяли путем сбора данных о частоте сердечных сокращений, отеке и функции левого желудочка. Была определена четкая корреляция между частотой сердечных сокращений и перфузионным давлением (рис. 2). Частота сердечных сокращений была статистически выше в сердцах с высоким давлением по сравнению с сердцами с низким давлением во все временные точки, кроме первого (60 мин, рис. 2A, B). Интересно, что сердца с низким давлением, по-видимому, претерпевают период адаптации в начале перфузии, когда потребовалось около 30 минут, чтобы частота сердечных сокращений стабилизировалась и достигла уровней, которые поддерживались в течение оставшейся части перфузии (Рисунок 2A). Между группами также наблюдалась большая разница в пульсовом давлении левого желудочка (ЛЖЖ), при этом НЖЖ у сердец с высоким давлением был статистически выше, чем у сердец с низким давлением в каждый момент времени (рис. 3B). Этот устойчиво высокий спрос на работу привел к прогрессирующей потере функции в сердцах с высоким давлением со статистическим снижением LVPP, наблюдаемым после 2 ч перфузии (Рисунок 3A, B). С другой стороны, в сердцах с перфузией с низким давлением не наблюдалось потери функции, при этом LVPP оставалась неизменной в течение всего времени перфузии (рис. 3A, B). Подобно LVPP, сердца с высоким давлением демонстрировали более высокое сокращение сердечной мышцы (dP/dtmax) и расслабление (dP/dtmin) на протяжении всего времени перфузии по сравнению с сердцами с низким давлением (рис. 3C, D). В соответствии с этим, сердца с высоким давлением претерпевали прогрессирующую потерю сократительной способности и способности к расслаблению, причем оба параметра были статистически выше через 1 ч после начала перфузии по сравнению с последним часом перфузии. С другой стороны, сократительная способность сердечной мышцы и способность к расслаблению были сравнительно низкими в группе с низким давлением и оставались неизменными в течение 4 часов времени перфузии (рис. 3C, D). В дополнение к функциональным эффектам, высокое перфузионное давление в течение длительных периодов времени также усугубляет задержку интерстициальной жидкости в сердечных трансплантатах, что приводит к отеку. Этот отек был частично количественно определен в процентах изменения веса и привел к тому, что сердца с высоким давлением имели статистически более высокий прирост веса по сравнению с сердцами, перфузированными при низком давлении (Рисунок 2C). Рисунок 1: Настройка перфузионной системы. (A) Общая перфузионная установка. Пунктирные линии показывают порядок, в котором компоненты системы были соединены для оптимизации циркуляции перфузата. Сплошные цветные линии показывают порядок, в котором компоненты были соединены для оптимизации температуры перфузата. (B) Правильный способ работы с сердцем после канюляции, чтобы избежать опорожнения катетера и введения воздуха в коронарные артерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 2: Влияние давления на частоту сердечных сокращений и отек. (A) Частота сердечных сокращений, полученная в результате измерений внутрижелудочкового баллона. Сплошная линия — это медиана экспериментальных групп. Затененная область представляет собой межквартильный диапазон. (B) Площадь под кривой (AUC) данных о частоте сердечных сокращений для каждого часа перфузии. (C) Процент набора веса после 4 ч перфузии при низком и высоком давлении. Все данные выражены в виде медианы ± межквартильного диапазона (МКР). *p < 0,01, **p < 0,05, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Рисунок 3: Влияние давления на функцию левого желудочка. (A) Максимальное систолическое давление, построенное на графике с течением времени, обозначается как пульсовое давление левого желудочка (LVPP). Сплошная линия — это медиана экспериментальных групп. Затененная область представляет собой межквартильный диапазон. (B) Площадь под кривой LVPP (AUC) для каждого часа перфузии. (C) Сократительная способность сердечной мышцы, определяемая по максимальной производной импульса давления. (D) Расслабление сердечной мышцы, количественно определяемое по минимальной производной импульса давления. Все данные выражены в виде медианы ± межквартильного диапазона. *p < 0,01, **p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры. Ион Концентрация (ммоль/л) Na+  135–145 К +  <6.00 Ка +2  1.0–1.3 Кл –  96–106 Таблица 1: Допустимый диапазон концентраций ионов в перфузате.

Discussion

Перфузия Лангендорфа — это чрезвычайно гибкий метод, который позволяет создавать впечатляющие индивидуальные заказы и корректировки для удовлетворения широкого спектра экспериментальных потребностей. Такая адаптация допускается значительной регулируемостью большинства параметров перфузии, в том числе и перфузионных давлений. Из-за ретроградной природы Лангендорфа перфузионное давление эквивалентно коронарному перфузионному давлению, которое играет важную роль в работе сердца. Известно, что коронарное перфузионное давление (СРТ) непосредственно контролирует сердечную работу, поскольку широкий спектр сердечных индексов (т.е. давление в левом желудочке, сократительная способность (dP/dtmax), напряжение стенки, жесткость желудочков) прямо пропорционален СР 16,17,18. Исторически сложилось так, что в этой области использовалось перфузионное давление и, по сути, CPP, от 60 мм рт.ст. до 80 мм рт.ст. в попытке имитировать физиологические условия 5,8,15,19,20,21. Однако нефизиологичность ретроградной перфузии ex vivo в сочетании с высокой востребованностью работы приводит к потере сердечной функции со временем (рис. 3). С другой стороны, более низкое перфузионное давление (30-35 мм рт.ст.), несмотря на то, что оно не точно воспроизводит физиологические условия сердца крыс in vivo, по своей природе снижает потребность в сердечной работе и обеспечивает более длительное время перфузии (4 ч) без потери функции со временем (Рисунок 3) и уменьшения отека трансплантата (Рисунок 2C). Использование более низкого перфузионного давления, хотя и означает отклонение от физиологического ХТБ, по-видимому, обеспечивает важные преимущества по сравнению с использованием физиологического перфузионного давления, поскольку устранение существующей потери функции, зависящей от техники, во время перфузии Лангендорфа улучшает технику в более точную и предсказуемую модельную систему со значительным потенциалом для продвижения сердечно-сосудистых исследований. В частности, области исследований, которые приносят пользу и/или требуют увеличения времени перфузии для достижения научной значимости (т.е. медикаментозное лечение, анализ иммунологического ответа, редактирование генов, нормотермическое сохранение трансплантатов и т.д.), становятся все более важными в борьбе с ССЗ.

Перфузия Лангендорфа, бесспорно, является важным инструментом в области исследований сердечно-сосудистой системы. Таким образом, наряду со значительными преимуществами, которые этот научный метод представляет для исследовательского сообщества, он имеет важный уровень научной сложности. По сути, в рамках этого протокола есть несколько критических этапов, которые требуют тщательной стандартизации, в первую очередь для предотвращения повреждения сердечного трансплантата до, во время и сразу после начала перфузии. Первый шанс повреждения трансплантата незаметен во время промывания воротной вены. Эта промывка гепаринизированным физиологическим раствором направлена на удаление как можно большего количества цельной крови из сердечного трансплантата с двойной целью. Во-первых, он служит способом эвтаназии через обескровливание. Во-вторых, это сводит к минимуму вероятность свертывания крови в сердечном трансплантате во время извлечения, канюляции и транспортировки, поскольку цельная кровь крысы, как известно, имеет чрезвычайно короткую одеждураз 22,23. Однако после сотен успешных сердечных перфузий стало очевидно, что давление, оказываемое на организм крысы во время промывки, имеет огромное значение, при этом идеальное давление промывки составляет около 10 мм рт.ст. Более высокое давление промывки воротной вены, по-видимому, приводит к повреждению сосудистой сети сердечного трансплантата, что приводит к увеличению сосудистого сопротивления (Equation 1). Более высокое сосудистое сопротивление приводит к достижению целевого перфузионного давления при более низких скоростях потока. Этот дисбаланс между давлением и коронарным кровотоком отражается в создаваемом пульсовом давлении левого желудочка (ЛЖЖ), что приводит к значительной вариабельности.

Следующий случай возможного повреждения сердечного трансплантата происходит при подключении трансплантата к системе путем введения пузырьков воздуха в коронарные артерии. Пузырьки воздуха могут быть легко занесены при неправильном обращении с канюлированным сердцем (рисунок 1B) или неправильном удалении пузырьков из перфузионной системы перед пузырьковой ловушкой24. Из-за ретроградного характера этой системы, любое введение воздуха приведет к сердечной воздушной эмболии, что приведет к ишемическим повреждениям, фибрилляции и, очень часто, к гибели трансплантата. Наконец, последний критический шаг для обеспечения успеха протокола происходит во время начала перфузии. В отличие от подавляющего большинства рукописей, в которых сообщается об использовании метода Лангендорфа в качестве метода, инициирование перфузии в этом протоколе выполняется при относительно низких потоках (1 мл/мин) с постепенным увеличением (+0,2 мл/мин), что гарантирует полный контроль над давлением перфузии 5,8,15,19,20,21 . Это постепенное увеличение потока и, следовательно, давления имеет решающее значение, поскольку резкие изменения давления необратимо увеличивают сосудистое сопротивление и изменяют хрупкий баланс поток/давление.

Высокое сосудистое сопротивление при перфузиях Лангендорфа с контролируемым давлением имеет большое значение, так как целевое перфузионное давление достигается при более низких потоках, а трансплантаты получаются недостаточно перфузионными. Большая зависимость от этого идеального баланса между потоком и давлением, вероятно, является самым большим ограничением этого протокола, поскольку любое предшествующее повреждение трансплантата, преднамеренное (т.е. длительная холодовая консервация, повреждение теплой ишемии, инфаркт миокарда и т.д.) или непреднамеренное, приводит к увеличению сосудистого сопротивления. По сути, этот протокол особенно полезен для исследований, в которых эксперимент начинается после начала перфузии (т.е. медикаментозного лечения, анализа иммунологического ответа, редактирования генов, нормотермического сохранения трансплантата и т.д.), но не до. Это ограничение является прекрасным примером того, что метод Лангендорфа не подходит для всех целей, и особое внимание следует уделить адаптации параметров перфузии для лучшего удовлетворения экспериментальных потребностей.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана щедрым финансированием S.N.T. со стороны Национальных институтов здравоохранения США (K99/R00 HL1431149; R01HL157803) и Американской кардиологической ассоциации (18CDA34110049). Мы также выражаем признательность за финансирование со стороны Национального института здравоохранения США (R01DK134590; R24OD034189), Национальный научный фонд (EEC 1941543), стипендия Элеоноры и Майлза Шора Гарвардской медицинской школы, Фонд семьи Польски, премия Клафлина за выдающиеся научные достижения от имени Исполнительного комитета по исследованиям MGH и Детская школа Шрайнерс Бостон (грант #BOS-85115).

Materials

5-0 Suture Fine Scientific Tools 18020-50
14 G Angiocath Becton Dickinson 381867
16 G Angiocath Becton Dickinson 381957
24 mm Heart Chamber adaptors Radnoti 140132
Balloon Catheter  Radnoti 170423
BD Slip Tip Sterile Syringes- 10 mL Fisher Scientific 14-823-16E
BD Slip Tip Sterile Syringes- 1 mL Fisher Scientific 14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes- 50 mL Fisher Scientific 14-820-11
Bovine Serum Albumin Sigma A7906
Bubble Trap Compliance Chamber Radnoti 130149
Calcium Chloride Sigma C7902
Clamp Holder United Scientic RTCLMP1
Dextran Sigma 31389
DIN8 Extension Cable Iworx SKU C-DIN-EXT
Falcon High Clarity 50 mL conical tubes Fisher Scientific 14-432-22
GSC Go Science Crazy Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientific S13748
Heart  Chamber Radnoti 140160
Heated Water Circulator bath Cole Parmer N/A
Heparin sodium Injection Medplus G-0409-2720-0409-2721
Hydrocortisone Solu-Cortef MGH Pharmacy
Insulin Humulin R MGH Pharmacy
Insvasive Fluid Filled Blood Pressure Sensor Iworx SKU BP-10x
Iworx Data Acquisition System Iworx IX-RA-834
Krebs-Henseleit Buffer Sigma K3753
Left Ventricular Pressure Balloon Radnoti 170404
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head for Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor VWR MFLX77200-60
Masterflex L/S Standard Digital Pump Systems VWR MFLX07551-30
Membrane Oxygenating Chamber Radnoti 130144
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
Polyethylene Tubing Fisher Scientific 14-170-12H
Precision Pump Tubing-16 VWR MFLX96410-16
Sodium Bicarobonate Sigma 5761
Standard PHD ULTRA CP Syringe Pump Harvard Aparatus 88-3015
Tygon Transfer Tubing VWR MFLX95702-03
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cardiovascular Diseases (cvds). World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cardiovascular-diseases-(cvds) (2021)
  2. Amini, M., Zayeri, F., Salehi, M. Trend analysis of cardiovascular disease mortality, incidence, and mortality-to-incidence ratio: Results from global burden of disease study 2017. BMC Public Health. 21 (1), 401 (2021).
  3. Aune, S. E., Yeh, S. T., Zelinski, D. P., Angelos, M. G. Measurement of hydrogen peroxide and oxidant stress in a recirculating whole blood-perfused rat heart model. Resuscitation. 82 (2), 222-227 (2011).
  4. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff’s isolated perfused rat heart technique: A review. Int J Basic Clin Pharmacol. 4 (6), 1314-1322 (2015).
  5. Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
  6. Vervoorn, M., et al. Extended normothermic ex situ heart perfusion without functional decline. J Heart Lung Transplant. 43 (4), S156 (2024).
  7. Moeslund, N., et al. Ex-situ oxygenated hypothermic machine perfusion in donation after circulatory death heart transplantation following either direct procurement or in-situ normothermic regional perfusion. J Heart Lung Transplant. 42 (6), 730-740 (2023).
  8. Testai, L., Martelli, A., Cristofaro, M., Breschi, M. C., Calderone, V. Cardioprotective effects of different flavonoids against myocardial ischaemia/reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts. J Pharm Pharmacol. 65 (5), 750-756 (2013).
  9. Watanabe, M., Okada, T. Langendorff perfusion method as an ex vivo model to evaluate heart function in rats. Methods Mol Biol. 1816, 107-116 (2018).
  10. Chang, X., et al. Cardioprotective effects of salidroside on myocardial ischemia-reperfusion injury in coronary artery occlusion-induced rats and Langendorff-perfused rat hearts. Int J Cardiol. 215, 532-544 (2016).
  11. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212 (4), 804-814 (1967).
  12. Matsuura, H., et al. Positive inotropic effects of atp released via the maxi-anion channel in Langendorff-perfused mouse hearts subjected to ischemia-reperfusion. Front Cell Dev Biol. 9, 597997 (2021).
  13. Louradour, J., et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex-vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 10, 1293032 (2023).
  14. Ueoka, A., et al. Testosterone does not shorten action potential duration in Langendorff-perfused rabbit ventricles. Heart Rhythm. 19 (11), 1864-1871 (2022).
  15. Reichelt, M. E., Willems, L., Hack, B. A., Peart, J. N., Headrick, J. P. Cardiac and coronary function in the Langendorff-perfused mouse heart model. Exp Physiol. 94 (1), 54-70 (2009).
  16. Abel, R. M., Reis, R. L. Effects of coronary blood flow and perfusion pressure on left ventricular contractility in dogs. Circ Res. 27 (6), 961-971 (1970).
  17. Arnold, G., Morgenstern, C., Lochner, W. The autoregulation of the heart work by the coronary perfusion pressure. Pflugers Arch. 321 (1), 34-55 (1970).
  18. Iwamoto, T., Bai, X. J., Downey, H. F. Coronary perfusion related changes in myocardial contractile force and systolic ventricular stiffness. Cardiovasc Res. 28 (9), 1331-1336 (1994).
  19. Rossello, X., Hall, A. R., Bell, R. M., Yellon, D. M. Characterization of the Langendorff perfused isolated mouse heart model of global ischemia-reperfusion injury: Impact of ischemia and reperfusion length on infarct size and LDH release. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 21 (3), 286-295 (2016).
  20. Headrick, J. P., Peart, J., Hack, B., Flood, A., Matherne, G. P. Functional properties and responses to ischaemia-reperfusion in Langendorff perfused mouse heart. Exp Physiol. 86 (6), 703-716 (2001).
  21. Noly, P. E., Naik, S., Tang, P., Lei, I. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. (190), e64384 (2022).
  22. Garcia-Manzano, A., Gonzalez-Llaven, J., Lemini, C., Rubio-Poo, C. Standardization of rat blood clotting tests with reagents used for humans. Proc West Pharmacol Soc. 44, 153-155 (2001).
  23. Lewis, J. H., Van Thiel, D. H., Hasiba, U., Spero, J. A., Gavaler, J. Comparative hematology and coagulation: Studies on rodentia (rats). Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 82 (1), 211-215 (1985).
  24. Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).

Tags

Modified Langendorff PerfusionCardiovascular DiseasesCVD ResearchPerfusion ParametersExtended Perfusion TimesGraft Function LossPerfusion PressureExperimental NeedsDrug TreatmentsImmunological Response AnalysisGene EditingGraft Preservation
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Pendexter, C. A., Bolger-Chen, M., Lopera Higuita, M., Cronin, S. E. J., Rabi, S. A., Osho, A. A., Tessier, S. N. Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts. J. Vis. Exp. (208), e66815, doi:10.3791/66815 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image