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생체공학

Perfusion de Langendorff modifiée pour des temps de perfusion prolongés de greffes cardiaques de rongeurs

Published: June 14, 2024
doi:
10.3791/66815
, , , , , ,
1Center for Engineering in Medicine and Surgery,Harvard Medical School and Massachusetts General Hospital, 2Shriners Children’s Boston, 3Division of Cardiac Surgery, Corrigan Minehan Heart Center,Massachusetts General Hospital

Summary

Cet article démontre la faisabilité d’obtenir des temps de perfusion plus longs (4 h) de greffons cardiaques murins sans perte de fonction en utilisant des pressions de perfusion plus faibles (30-35 mmHg) que physiologiques (60-80 mmHg) pendant Langendorff.

Abstract

Malgré d’importants progrès dans le diagnostic et le traitement des maladies cardiovasculaires (MCV), le domaine a un besoin urgent d’accroître la recherche et les progrès scientifiques. Par conséquent, l’innovation, l’amélioration et/ou la réorientation de l’ensemble des outils de recherche disponibles peuvent fournir des bancs d’essai améliorés pour l’avancement de la recherche. La perfusion de Langendorff est une technique de recherche extrêmement précieuse pour le domaine de la recherche sur les MCV qui peut être modifiée pour répondre à un large éventail de besoins expérimentaux. Cette adaptation peut être réalisée en personnalisant un grand nombre de paramètres de perfusion, notamment la pression de perfusion, le débit, le perfusat, la température, etc. Ce protocole démontre la polyvalence de la perfusion de Langendorff et la faisabilité d’obtenir des temps de perfusion plus longs (4 h) sans perte de fonction du greffon en utilisant des pressions de perfusion plus faibles (30-35 mmHg). L’obtention de temps de perfusion prolongés sans endommager le greffon et/ou perdre la fonction causée par la technique elle-même a le potentiel d’éliminer les éléments confondants des résultats expérimentaux. En effet, dans des circonstances scientifiques où des temps de perfusion plus longs sont pertinents pour les besoins expérimentaux (c’est-à-dire les traitements médicamenteux, l’analyse de la réponse immunologique, l’édition de gènes, la préservation du greffon, etc.), des pressions de perfusion plus faibles peuvent être la clé du succès scientifique.

Introduction

Le domaine de la recherche cardiovasculaire a connu d’importants progrès dans le diagnostic et le traitement des maladies cardiovasculaires (MCV). Cependant, malgré la baisse générale des taux d’incidence et de mortalité, les MCV restent la principale cause de décès dans le monde 1,2. Ce fait alarmant met en évidence la nécessité d’accroître la recherche et le progrès scientifique, qui dépendent sans aucun doute de la précision et de la prévisibilité des outils de recherche disponibles. Par conséquent, il y a un besoin constant d’innovation, d’amélioration et/ou de réorientation de l’ensemble des outils de recherche. Par exemple, la perfusion cardiaque rétrograde ou de Langendorff, une technique disponible dans le domaine depuis plus d’un siècle, peut être facilement modifiée pour couvrir un plus large éventail de besoins scientifiques et atteindre un plus large éventail d’applications.

L’isolement du greffon cardiaque du reste de l’organisme pendant la perfusion de Langendorff offre un degré important de contrôle sur un large éventail de paramètres expérimentaux, y compris la température, la solution circulante, les pressions de perfusion coronaire, etc.3,4,5,6,7. La manipulation de ces paramètres facilite la simulation d’un grand nombre de scénarios cardiaques qui peuvent être exploités pour faire progresser la science 5,8,9,10. Parmi ces paramètres, la pression de perfusion est probablement le cadre expérimental le plus négligé11.

Au cours de Langendorff, les pressions de perfusion présentent une corrélation directe avec la fréquence cardiaque, les pressions systoliques/diastoliques maximales et la consommation d’oxygène11. Cette corrélation permet un contrôle direct et précis de la quantité de travail produite par les greffons cardiaques, qui peut être ajustée pour répondre aux besoins expérimentaux individuels. Malgré cette précieuse capacité de contrôle, le domaine a historiquement évolué vers l’utilisation de pressions de perfusion plus élevées (60-80 mmHg), soumettant toutes les greffes cardiaques à une forte demande de travail, indépendamment des besoins expérimentaux 8,12,13,14,15. Les conséquences de cette demande de travail inutilement élevée découlent du principe général selon lequel le surmenage a tendance à entraîner un échec prématuré. Cela semble être particulièrement vrai pour les greffes cardiaques perfusées via Langendorff, car la nature non physiologique de cette méthode et l’absence de support de récupération présent in vivo semblent exacerber l’échec de la greffe. Cette perte prématurée de la fonction du greffon limite considérablement la perfusion et les temps d’expérimentation. En effet, dans des circonstances où des temps de perfusion plus longs sont plus pertinents pour les besoins expérimentaux (c’est-à-dire les traitements médicamenteux, l’analyse de la réponse immunologique, l’édition de gènes, la préservation du greffon, etc.), un travail cardiaque plus faible peut être permis, en échange d’une durabilité accrue du greffon.

Ce protocole démontre la faisabilité de l’utilisation de pressions de perfusion plus faibles (30-35 mmHg) pendant Langendorff, ainsi que l’effet significatif que celles-ci posent sur la fonction du greffon cardiaque au fil du temps par rapport à des pressions de perfusion plus élevées (60-80 mmHg). De plus, les résultats de ce manuscrit soulignent l’importance de donner la priorité à la personnalisation du large éventail de paramètres de perfusion pour mieux répondre aux besoins expérimentaux.

Protocol

Cette étude est menée à la suite de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Massachusetts General Hospital. 1. Conception du système Assemblez le système avec les trois composants à double enveloppe, y compris un piège à bulles, un réservoir, un oxygénateur, une pompe péristaltique et un circulateur d’eau. Fixez tous les composants chemisés à un support de serrage. Connectez les composants en séquence avec un tube en silicone dans deux séquences différentes (Figure 1A).Séquence 1 – Schéma d’écoulement de l’eau à travers l’enveloppe (lignes continues à la figure 1A) :Raccordez l’écoulement du circulateur d’eau à l’entrée inférieure de la chemise du piège à bulles à l’aide d’un tube de 36 G. Cela garantira que le perfusat est maintenu à la bonne température (37 °C) avant d’atteindre le cœur, car l’eau perdra de la chaleur en traversant les autres composants du système. Connectez l’entrée supérieure de la gaine du piège à bulles à l’entrée inférieure de la chemise du réservoir à l’aide d’un tube de la même taille. Par la suite, connectez l’entrée supérieure de l’enveloppe du réservoir à l’entrée inférieure de l’enveloppe de l’oxygénateur. Enfin, connectez l’entrée supérieure de l’oxygénateur à l’entrée du circulateur d’eau. Séquence 2 – Schéma d’écoulement du perfusat dans le système (lignes pointillées sur la figure 1A)Fixez les connecteurs Luer des deux côtés du tube 16 G. Fixez la première extrémité à la base du réservoir et faites-la passer par la tête de pompe péristaltique. Connectez l’autre extrémité à l’une des entrées de la bobine de silicone à l’intérieur de l’oxygénateur. Connectez un deuxième morceau de tube 16 G, équipé de connecteurs Luer Lock aux deux extrémités, à la deuxième entrée de la bobine de silicone de l’oxygénateur à l’entrée du piège à bulles avec la longue saillie. Connectez un morceau plus court de tube 16 G, équipé de connecteurs Luer, à la sortie inutilisée du piège à bulles à une vanne Luer Lock à trois voies. Sur le côté opposé de la vanne à trois voies, connectez un morceau de tube 16 G avec une deuxième valve Luer à l’autre extrémité. Cette deuxième soupape se trouve immédiatement au-dessus du réservoir. Connectez le côté opposé de la vanne à d’autres tubes de 16 G, puis au capteur de pression. Connectez un tube de plus petit diamètre (3,7 mm) à l’orifice vertical de la valve à trois voies avec un connecteur à la canule (angiocath 14 G). Le perfusat s’écoule du réservoir vers l’oxygénateur à travers le piège à bulles avant de recirculer dans le réservoir par la connexion de la canule aortique. 2. Préparation du perfusat Préparez du perfusat de base, 0,96 % de tampon Krebs-Henseleit, 9,915 mM de dextran, 25 mM de bicarbonate de sodium, 1,054 mM d’albumine sérique bovine, 1 % de streptocoque stylo, 0,13 % d’insuline, 0,02 % d’hydrocortisone, 0,5 % d’héparine et 2,75 mM de chlorure de calcium et portez au volume avec de l’eau distillée. 3. Configuration du système de perfusion Connectez deux seringues de 10 ml aux orifices d’aération supérieur et latéral du piège à bulles. Ajouter le perfusat de base (75 ml) dans le réservoir. Allumez la pompe péristaltique et réglez le circulateur d’eau à 37 °C. Connectez une conduite d’oxygène (95 % O2 et 5 % CO2) à la troisième entrée de l’oxygénateur et oxygénez le perfusat à un pO2 minimum de 400 mmHg. Fixez un orifice d’injection à l’orifice vertical de la vanne à trois voies immédiatement après le piège à bulles. Connecter une aiguille de perfusion à oreilles avec une seringue de 1 mL à l’orifice d’injection (utilisé pour l’échantillonnage). Tapotez doucement l’orifice d’injection ou prélevez le perfusat avec la seringue de 1 ml pour éliminer les bulles introduites dans le circuit. Une fois que le perfusat de base a atteint la température et le niveau d’oxygène, effectuez une lecture initiale des paramètres biochimiques pour assurer une concentration correcte en ions (tableau 1) et une bonne oxygénation.REMARQUE : Les niveaux d’ions et de pH doivent être lus après que la solution a été portée à température (37 °C) et a été oxygénée avec le mélange gazeux approprié (95% O2, 5% CO2). Mettez le capteur de pression à zéro en desserrant le tube connecté et laissez le flux de perfusat à travers le capteur ouvert et la canule de s’équilibrer. Une fois équilibré, appuyez sur le bouton zéro dans le boîtier du capteur et refixez le tube. Enregistrez les pressions de base avant la fixation du cœur au système pour des débits allant de 1 mL/min à 15 mL/min. Perfusion à basse pressionAdénosine goutte à goutte : Effectuer une première quantité de 20 mM d’adénosine dans le perfusat de base. Dissoudre l’adénosine en plaçant le tube dans un bain d’eau chaude et en mélangeant par inversion. Diluer l’adénosine d’origine à l’aide d’une dilution de 0,06 mg/mL dans du perfusat de base et l’ajouter à une seringue de 50 mL. Fixez une aiguille de perfusion à oreilles à la seringue de 50 ml et connectez-la à l’orifice d’injection de la valve à trois voies. Fixez la seringue à un pousse-seringue et réglez-la à une vitesse de perfusion de 166,6 μL/min.REMARQUE : Les bulles sont libérées de l’orifice d’infusion en tapotant ou en effleurant légèrement l’orifice. Perfusion à haute pression :Isolement des globules rouges emballés (pGRC) :Prélever 10 à 12 ml de sang total de rat par ponction cardiaque sur un rat donneur. Centrifuger le sang à 2000 x g pendant 10 min. Retirez la couche de plasma et de couche leucytaire par pipetage. Remettre en suspension les globules rouges dans du perfusat sans chlorure de calcium dans un rapport de 1:1 (p. ex., 5 mL de globules rouges : 5 mL de perfusat) par mélange par inversion. Répétez deux fois les étapes 3.8.1.2-3.8.1.4 pour un total de 3 lavages. Après le dernier lavage, remettre les cellules en suspension dans le perfusat dans un rapport de 1:1 et ajouter le mélange au système de perfusion, contenant déjà les 75 ml de perfusat de base. Laissez les cellules se répartir uniformément dans le système et mesurez l’hématocrite du perfusat à l’aide d’un appareil d’hématologie. L’hématocrite varie de 5 % à 7 %. 4. Préparation de l’obtention d’un greffon cardiaque Amorcez complètement le système de perfusion avant de commencer l’approvisionnement afin de minimiser le temps d’ischémie froide. Préparez les outils chirurgicaux. Les outils chirurgicaux comprennent des coussinets bleus, du ruban chirurgical, des sutures en soie 5-0, des cotons-tiges, des seringues salines (50 ml et 10 ml), des ciseaux opératoires, des pinces, des micro-ciseaux, des micro-pinces, une pince Halstead, 30 U d’héparine, un tube de 16 G pour le rinçage du portique, un tube de 14 G pour la canulation du cœur, un angiocath de 16 G, un angiocath modifié de 14 G avec brassard, un capteur de pression, seau à glace avec de la glace, boîte de Pétri de 47 mm, gaze. Créez une canule modifiée en insérant un mince anneau de tube (diamètre intérieur [ID] 0,167 mm, diamètre extérieur [OD] 2,42 mm) sur la canule 14 G, créant ainsi un effet de brassard.Retirez l’aiguille de la canule et ajoutez une goutte de super colle sous l’anneau. Faites glisser délicatement l’anneau à 1/4 de pouce au-dessus de la base de la canule. Laissez sécher la colle avant de l’utiliser. Coupez la canule le plus près possible du brassard en biais et retirez les arêtes vives. Remplissez une seringue de 60 ml avec une solution saline héparinée (0,03 U/mL) pour le rinçage de la veine porte. Connectez la seringue au capteur de pression, puis au tube de rinçage de 16 G. Connectez une seringue de 10 ml de solution saline héparinée (0,03 U/mL) au tube de 14 G. Connectez l’autre extrémité du tube à la canule aortique et rincez pour éliminer les bulles d’air. Placez la canule aortique dans une boîte de Pétri de 47 mm avec de la gaze et remplie de solution saline. Laissez la boîte de Pétri sur de la glace jusqu’à ce que le cœur soit connecté au système de perfusion. 5. Prélèvement d’un greffon cardiaque Anesthésier les rats dans une chambre d’anesthésie avec 3% d’isoflurane. Une fois que les réflexes ne sont pas remarqués, retirez le rat de la chambre, placez-le dans l’espace chirurgical et délivrez de l’isoflurane continu (3%) via un masque facial. Après le test de pincement des orteils, héparinisez l’animal à travers la veine du pénis avec 30 U d’héparine. Rasez le rat sur tout l’abdomen et le haut de la poitrine. Retirez les copeaux de fourrure du champ chirurgical. Collez chaque membre pour vous assurer qu’il n’y a aucun mouvement pendant la chirurgie. Faites une incision horizontale médiane dans la peau du bas-ventre, exposant les muscles abdominaux. Faites une deuxième incision horizontale médiane dans les muscles abdominaux en exposant les organes internes. Révélez le sternum, fixez-le avec un hémostat et rétractez-le crânien pour exposer le foie et la veine porte. Canuler la veine porte à l’aide d’un angiocath de calibre 16. Fixez la seringue de 60 ml de solution saline héparinée à l’angiocath et créez une incision dans la veine cave inférieure et l’aorte abdominale pour la ventilation. Rincez toute la quantité de solution saline par la veine porte.REMARQUE : La pression de rinçage doit rester autour de 10 mmHg. Faites une coupe horizontale dans le diaphragme, suivie d’une coupe proximale à travers les côtes des deux côtés du sternum pour révéler la cavité thoracique. Retirez le cœur de la cavité et placez-le immédiatement sur la boîte de Pétri avec une solution saline sur de la glace. Identifiez l’arc aortique, clampez avec des hémostats et exposez l’aorte descendante en nettoyant tout tissu conjonctif restant. Faites une incision horizontale à mi-chemin de l’aorte descendante et canulez avec l’angiocath 14 G.REMARQUE : Ne percez pas la valve aortique avec la canule. Fixez la canule à l’aide d’une suture au-dessus du brassard et libérez l’hémostat. Laissez le cœur rester sur la glace jusqu’à ce qu’il soit placé dans le système de perfusion. 6. Initiation de la perfusion Réglez le débit de la pompe péristaltique à 1,0 mL/min.REMARQUE : La canule aortique est toujours manipulée à un angle de 90° par rapport au cœur pour éviter l’introduction de bulles dans les coronaires (Figure 1B). Pesez le cœur avec la canule avant de fixer le cœur au système.REMARQUE : La canule aortique doit être complètement exempte de bulles d’air. Fixez la canule au connecteur du système et démarrez une minuterie. Une fois que le cœur a une contraction complète, augmentez le débit par incréments de 0,2 ml/min tout en surveillant de près les pressions. Arrêtez les augmentations de débit lorsque les pressions souhaitées sont atteintes ou jusqu’à ce qu’un minimum de 3,5 mL/min soit atteint.Perfusion à basse pressionPour des pressions comprises entre 30 et 35 mmHg, utilisez un débit de 4,5 mL/min. Démarrez le pousse-seringue d’adénosine. Perfusion à haute pressionPour des pressions comprises entre 70 et 80 mmHg, utilisez un débit minimum de 5,0 mL/min. Démarrez le pousse-seringue d’adénosine. 7. Ballon intraventriculaire : Fixez un petit ballonnet en latex (50 μL) à un cathéter à ballonnet (2 mm de diamètre, 15 cm de long) avec une pointe effilée (1,4 mm de diamètre). Connectez le cathéter à un capteur de pression via un connecteur Luer Lock et fixez l’ensemble de la configuration à un support de pince. Remplissez le ballonnet/cathéter/capteur de pression avec environ 200 μL de solution saline à l’aide d’une seringue fixée à l’extrémité supérieure du capteur de pression, et retirez les bulles de l’intérieur du capteur, du cathéter et du ballonnet. Calibrez le capteur de pression à l’aide d’un tensiomètre. Faites une petite incision horizontale au-dessus de l’oreillette gauche. Dégonflez le ballonnet en tirant la seringue en haut du capteur de pression et en l’insérant dans le ventricule gauche. Lancez l’acquisition des données et gonflez le ballonnet jusqu’à ce que les pressions diastoliques indiquent 0 mmHg. 8. Échantillonnage Recueillez la fréquence cardiaque, le débit aortique et les pressions coronaires après les 20 premières minutes de perfusion et toutes les heures par la suite. 9. Fin/nettoyage À la fin de la perfusion, retirez le cœur du système et pesez-le pour l’estimation de l’œdème. Coupez l’apex du cœur par une coupe circonférentielle et une congélation instantanée dans de l’azote liquide pour des analyses post-perfusion. Coupez un morceau circonférentiel du cœur pour l’imagerie histologique et la coloration. Disposer du reste du cœur et de la canule. Rincez tous les composants du système en ajoutant de grandes quantités d’eau déminéralisée (DI) dans le réservoir et en faisant fonctionner la pompe péristaltique. Récupérez l’eau dans un seau externe. Répétez l’étape 9.4 deux à trois fois. Rincez soigneusement tous les orifices d’échantillonnage et la tubulure du capteur de pression. Remplissez le réservoir avec 600 ml d’eau DI et 3 ml de pompe à détergent de qualité laboratoire dans tout le système. Éteignez le chauffe-eau, le réservoir d’oxygène et la pompe péristaltique.

Representative Results

Des cœurs de rats Lewis mâles adultes (250 à 300 g de poids corporel) ont été prélevés et perfusés à des pressions de perfusion élevées (70 à 80 mmHg) ou faibles (30 à 35 mmHg) (n = 3 par groupe). Les effets de la pression de perfusion sur la fonction cardiaque globale et la santé ont été déterminés en recueillant la fréquence cardiaque, l’œdème et la fonction ventriculaire gauche. Une corrélation claire entre la fréquence cardiaque et les pressions de perfusion a été déterminée (Figure 2). La fréquence cardiaque était statistiquement plus élevée dans les cœurs à haute pression par rapport aux cœurs à basse pression pour tous les points temporels, sauf le premier (60 min, Figure 2A,B). Il est intéressant de noter que les cœurs à basse pression semblent subir une période d’ajustement au début de la perfusion, où il a fallu environ 30 minutes pour que la fréquence cardiaque se stabilise et atteigne les niveaux qui ont été maintenus pendant le reste de la perfusion (Figure 2A). Une grande différence dans la pression du pouls ventriculaire gauche (LVPP) a également été observée entre les groupes, la LVPP des cœurs à haute pression étant statistiquement plus élevée que celle des cœurs à basse pression à chaque point temporel (Figure 3B). Cette forte demande de travail soutenue a entraîné une perte progressive de fonction dans les cœurs à haute pression avec une diminution statistique de la LVPP observée après 2 h de perfusion (Figure 3A,B). Par ailleurs, aucune perte de fonction n’était présente dans les cœurs perfusés à basse pression, la LVPP restant inchangée tout au long du temps de perfusion (Figure 3A, B). À l’instar du LVPP, les cœurs à haute pression présentaient une contraction du muscle cardiaque (dP/dtmax) et une relaxation (dP/dtmin) plus élevées tout au long du temps de perfusion par rapport aux cœurs à basse pression (Figure 3C,D). En conséquence, les cœurs à haute pression ont subi une perte progressive de contractilité et de capacité de relaxation, les deux paramètres étant statistiquement plus élevés 1 heure après le début du temps de perfusion par rapport à la dernière heure de perfusion. Différemment, la contractilité du muscle cardiaque et les capacités de relaxation étaient comparativement faibles dans le groupe à basse pression et sont restées inchangées sur 4 h de temps de perfusion (Figure 3C,D). En plus des effets fonctionnels, des pressions de perfusion élevées sur de longues périodes exacerbent également la rétention de liquide interstitiel dans les greffons cardiaques, entraînant un œdème. Cet œdème a été semi-quantifié en pourcentage de changement de poids et a entraîné une prise de poids statistiquement plus élevée chez les cœurs à haute pression que chez les cœurs perfusés à basse pression (figure 2C). Figure 1 : Configuration du système de perfusion. (A) Configuration globale de la perfusion. Les lignes pointillées représentent l’ordre dans lequel les composants du système ont été connectés pour optimiser la circulation des perfusats. Les lignes continues et colorées représentent l’ordre dans lequel les composants ont été connectés pour optimiser la température de perfusat. (B) La bonne façon de manipuler le cœur après la canulation pour éviter de vider le cathéter et d’introduire de l’air dans les coronaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Effets de la pression sur la fréquence cardiaque et l’œdème. (A) Fréquence cardiaque obtenue à partir des mesures du ballonnet intraventriculaire. La ligne continue est la médiane des groupes expérimentaux. La zone ombrée est l’écart interquartile. (B) Aire sous la courbe (AUC) des données de fréquence cardiaque pour chaque heure de perfusion. (C) Pourcentage de poids gagné après 4 h de perfusion à basse et haute pression. Toutes les données sont exprimées en médiane ± écart interquartile (IQR). *p < 0,01, **p < 0,05, ***p < 0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Effets de la pression sur la fonction ventriculaire gauche. (A) Pression systolique maximale tracée dans le temps, désignée par la pression du pouls ventriculaire gauche (LVPP). La ligne continue est la médiane des groupes expérimentaux. La zone ombrée est l’écart interquartile. (B) L’aire sous la courbe LVPP (AUC) pour chaque heure de perfusion. (C) Contractilité du muscle cardiaque quantifiée à partir de la dérivée maximale de l’impulsion de pression. (D) Relaxation du muscle cardiaque quantifiée à partir de la dérivée minimale de l’impulsion de pression. Toutes les données sont exprimées en médiane ± en écart interquartile. *p < 0,01, **p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Ion Concentration (mmol/L) Na+  135–145 K +  6,00 < Ca +2  1.0–1.3 Cl –  96–106 Tableau 1 : Plage acceptable de concentration ionique dans le perfusat.

Discussion

La perfusion de Langendorff est une technique extrêmement souple qui permet une adaptation et un ajustement impressionnants pour répondre à un large éventail de besoins expérimentaux. Cette adaptation est permise par l’ajustement significatif de la plupart des paramètres de perfusion, y compris les pressions de perfusion. En raison de la nature rétrograde de Langendorff, les pressions de perfusion sont équivalentes aux pressions de perfusion coronaires, qui jouent un rôle essentiel dans la fonction cardiaque. Les pressions de perfusion coronaire (PPC) sont connues pour contrôler directement le travail cardiaque, car un large éventail d’indices cardiaques (c’est-à-dire la pression ventriculaire gauche, la contractilité (dP/dtmax), la tension de la paroi, la rigidité ventriculaire) sont directement proportionnels à la PPC 16,17,18. Historiquement, le domaine a utilisé des pressions de perfusion, et en fait CPP, entre 60 mmHg et 80 mmHg dans le but d’imiter les conditions physiologiques 5,8,15,19,20,21. Cependant, la nature non physiologique de la perfusion automatique ex vivo rétrograde, combinée à la forte demande de travail, entraîne une perte de la fonction cardiaque au fil du temps (Figure 3). Par ailleurs, des pressions de perfusion plus faibles (30-35 mmHg), bien qu’elles ne reproduisent pas fidèlement les conditions physiologiques des cœurs de rat in vivo, diminuent intrinsèquement la demande de travail cardiaque et atteignent des temps de perfusion prolongés (4 h) sans perte de fonction au fil du temps (Figure 3), et diminuent l’œdème du greffon (Figure 2C). L’utilisation de pressions de perfusion plus faibles, bien qu’elle signifie un écart par rapport à la PPC physiologique, semble offrir des avantages importants par rapport à l’utilisation de pressions de perfusion physiologiques, car l’élimination de la perte de fonction dépendante de la technique pendant la perfusion de Langendorff améliore la technique en un système modèle plus précis et prévisible avec un potentiel significatif pour faire progresser la recherche cardiovasculaire. En particulier, les domaines de recherche qui bénéficient et/ou nécessitent des temps de perfusion prolongés pour atteindre une pertinence scientifique (c’est-à-dire les traitements médicamenteux, l’analyse de la réponse immunologique, l’édition de gènes, la préservation normothermique des greffons, etc.) deviennent de plus en plus importants dans la lutte contre les MCV.

La perfusion de Langendorff est incontestablement un outil essentiel pour le domaine de la recherche cardiovasculaire. Par conséquent, en plus des avantages significatifs que cette technique scientifique présente pour la communauté des chercheurs, elle s’accompagne d’un niveau important de complexité scientifique. En effet, plusieurs étapes critiques de ce protocole nécessitent une standardisation minutieuse, principalement pour éviter les dommages à la greffe cardiaque avant, pendant et immédiatement après le début de la perfusion. Le premier risque de dommages au greffon est discret lors du rinçage de la veine porte. Ce rinçage avec une solution saline héparinisée vise à retirer autant de sang total que possible de la greffe cardiaque avec un double objectif. Tout d’abord, il s’agit d’un moyen d’euthanasie par exsanguination. Deuxièmement, il minimise les risques de coagulation dans le greffon cardiaque lors de la récupération, de la canulation et du transport, car le sang total de rat est connu pour avoir des temps de port extrêmement courts22,23. Cependant, après des centaines de perfusions cardiaques réussies, il est devenu évident que la pression appliquée à l’organisme du rat pendant le rinçage est d’une importance capitale, la pression idéale étant d’environ 10 mmHg. Des pressions plus élevées dans le rinçage de la veine porte semblent entraîner des dommages au système vasculaire du greffon cardiaque, entraînant une augmentation de la résistance vasculaire (Equation 1). Une résistance vasculaire plus élevée permet en effet d’atteindre les pressions de perfusion cibles à des débits plus faibles. Ce déséquilibre entre la pression et le flux coronaire est véhiculé par la pression du pouls ventriculaire gauche (LVPP), ce qui entraîne une variabilité importante.

Le prochain cas de lésion possible du greffon cardiaque se produit lors de la connexion du greffon au système via l’introduction de bulles d’air dans les coronaires. Les bulles d’air peuvent être facilement introduites en manipulant mal le cœur canulé (figure 1B) ou en enlevant mal les bulles du système de perfusion en amont du piège à bulles24. En raison de la nature rétrograde de cette configuration, toute introduction d’air entraînera une embolie gazeuse cardiaque, entraînant des lésions ischémiques, une fibrillation et, très fréquemment, la mort du greffon. Enfin, la dernière étape critique pour assurer le succès du protocole se produit lors de l’initiation de la perfusion. Contrairement à la grande majorité des manuscrits qui rapportent l’utilisation de Langendorff comme technique, l’initiation de la perfusion dans ce protocole est effectuée à des débits relativement faibles (1 mL/min) avec des augmentations progressives (+0,2 mL/min), ce qui garantit un contrôle total des pressions de perfusion 5,8,15,19,20,21 . Cette augmentation progressive du débit, et donc de la pression, est essentielle car les changements brusques de pression augmentent de manière irréversible la résistance vasculaire et modifient l’équilibre délicat entre le débit et la pression.

Une résistance vasculaire élevée dans les perfusions de Langendorff contrôlées par pression est très importante, car les pressions de perfusion cibles sont atteintes à des débits plus faibles et les greffons sont sous-perfusés. La grande dépendance à cet équilibre parfait entre le débit et la pression est probablement la plus grande limitation de ce protocole, car tout dommage antérieur au greffon, intentionnel (c’est-à-dire une conservation prolongée au froid, une agression d’ischémie chaude, un infarctus du myocarde, etc.) ou non intentionnel, entraîne une résistance vasculaire accrue. En effet, ce protocole est particulièrement utile pour les recherches où l’expérience commence après le début de la perfusion (c’est-à-dire les traitements médicamenteux, l’analyse de la réponse immunologique, l’édition de gènes, la préservation normothermique du greffon, etc.) mais pas avant. Cette limitation est un exemple parfait d’un Langendorff qui ne convient pas à tous les usages et un soin particulier doit être pris pour adapter les paramètres de perfusion afin de mieux répondre aux besoins expérimentaux.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par un généreux financement accordé à S.N.T. par les National Institutes of Health des États-Unis (K99/R00 HL1431149 ; R01HL157803) et de l’American Heart Association (18CDA34110049). Nous remercions également le National Institute of Health des États-Unis (R01DK134590 ; R24OD034189), la National Science Foundation (EEC 1941543), la bourse Eleanor et Miles Shore de la Harvard Medical School, la Polsky Family Foundation, le Claflin Distinguished Scholar Award au nom du comité exécutif de la recherche de l’HGM et l’Hôpital Shriners pour enfants de Boston (subvention #BOS-85115).

Materials

5-0 Suture Fine Scientific Tools 18020-50
14 G Angiocath Becton Dickinson 381867
16 G Angiocath Becton Dickinson 381957
24 mm Heart Chamber adaptors Radnoti 140132
Balloon Catheter  Radnoti 170423
BD Slip Tip Sterile Syringes- 10 mL Fisher Scientific 14-823-16E
BD Slip Tip Sterile Syringes- 1 mL Fisher Scientific 14-823-434
BD Slip Tip Sterile Syringes- 50 mL Fisher Scientific 14-820-11
Bovine Serum Albumin Sigma A7906
Bubble Trap Compliance Chamber Radnoti 130149
Calcium Chloride Sigma C7902
Clamp Holder United Scientic RTCLMP1
Dextran Sigma 31389
DIN8 Extension Cable Iworx SKU C-DIN-EXT
Falcon High Clarity 50 mL conical tubes Fisher Scientific 14-432-22
GSC Go Science Crazy Cast Iron Support Ring Stand Fisher Scientific S13748
Heart  Chamber Radnoti 140160
Heated Water Circulator bath Cole Parmer N/A
Heparin sodium Injection Medplus G-0409-2720-0409-2721
Hydrocortisone Solu-Cortef MGH Pharmacy
Insulin Humulin R MGH Pharmacy
Insvasive Fluid Filled Blood Pressure Sensor Iworx SKU BP-10x
Iworx Data Acquisition System Iworx IX-RA-834
Krebs-Henseleit Buffer Sigma K3753
Left Ventricular Pressure Balloon Radnoti 170404
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head for Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor VWR MFLX77200-60
Masterflex L/S Standard Digital Pump Systems VWR MFLX07551-30
Membrane Oxygenating Chamber Radnoti 130144
Penicillin-Streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122
Polyethylene Tubing Fisher Scientific 14-170-12H
Precision Pump Tubing-16 VWR MFLX96410-16
Sodium Bicarobonate Sigma 5761
Standard PHD ULTRA CP Syringe Pump Harvard Aparatus 88-3015
Tygon Transfer Tubing VWR MFLX95702-03
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References

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Pendexter, C. A., Bolger-Chen, M., Lopera Higuita, M., Cronin, S. E. J., Rabi, S. A., Osho, A. A., Tessier, S. N. Modified Langendorff Perfusion for Extended Perfusion Times of Rodent Cardiac Grafts. J. Vis. Exp. (208), e66815, doi:10.3791/66815 (2024).
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