遺伝子治療の分野が進化し続ける中、これらの課題に対処できる革新的な方法の必要性が高まっています。ここでは、細胞工場プラットフォームを使用して高収量で高純度のAAVベクターを生成するプロセスを効率化し、 in vivo 研究の品質基準を満たす独自の方法を紹介します。
前臨床遺伝子治療研究、特にげっ歯類や大動物モデルでは、高収率で高純度のAAVベクターの作製が必要です。研究室での従来のアプローチでは、細胞培養皿を多用してHEK293T細胞を培養することが多く、このプロセスは面倒で問題となる可能性があります。ここでは、特定のセルファクトリ(またはセルスタック、CF10)プラットフォームでこのプロセスを簡素化する独自の社内方法を紹介します。ポリエチレングリコール/水性二相分配とヨージキサノールグラジエント超遠心分離の統合により、生成されたAAVベクターの収率と純度の両方が向上します。AAVベクターの純度はSDS-PAGEおよび銀染色によって検証され、満杯粒子と空粒子の比率は透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して決定されます。このアプローチは、AAVベクターを高収率で生産するための効率的な細胞工場プラットフォームを提供するとともに、 in vivo 研究の品質要求を満たすための改良された精製方法を提供します。
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、遺伝子治療研究に不可欠なツールとなり、遺伝子導入の有効性と安全性を独自に組み合わせています1。実験室でAAVを生成する従来の方法は、遺伝子治療の理解と応用を進める上で極めて重要でした2。しかし、これらの方法は基礎的なものであるが、特に収率、時間効率、および生成されるベクターの品質、特に満杯粒子と空粒子の比率3の点で、一定の制限と課題を示す。
従来のAAV産生の手順は、主にHEK293細胞のトランスフェクションを伴います4。このプロセスは、通常、細胞培養皿で行われ、目的の遺伝子を含むプラスミドを細胞にトランスフェクションし、ヘルパープラスミドおよびAAVキャプシドプラスミド5,6とともにトランスフェクションする必要があります。トランスフェクション後、細胞はAAV粒子を産生し、それを回収して精製します5,6。精製プロセスには、高純度AAVベクターを得るための重要なステップである超遠心分離がしばしば含まれます7。超遠心分離、特に塩化セシウム(CsCl)またはヨージキサノールグラジエントを使用する方法は、AAV粒子を細胞の破片やその他の不純物から分離するための標準的な方法です8。このステップは、遺伝子導入におけるAAVベクターの有効性に直接影響するAAVベクターの所望の純度と濃度を達成するために重要です8。その広範な使用にもかかわらず、従来の超遠心分離には欠点があります。例えば、この方法によるAAVベクターの収量は変動し、しばしば低くなる可能性があるため、特にin vivo研究や大型動物モデル9の場合、大量の高力価ベクターが必要な場合に重大な課題が生じます。
AAVベクトル品質のもう一つの重要な側面は、満杯の粒子と空の粒子の比率である10。AAV製剤には、多くの場合、これらの粒子の混合物が含まれています。しかし、治療用遺伝物質を含むのは完全な粒子のみです。空粒子の割合が高いと、遺伝子送達の効率が著しく低下する可能性があります10。したがって、満杯の粒子と空の粒子の比率を評価して最適化することは、AAV ベクトルの有効性を評価するための重要なパラメーターです。従来の方法は、AAVベクトルを生成することができますが、この比率を一貫して制御するのが難しいことが多く、ベクトルの効力のばらつきにつながります10。
ここでは、細胞皿に労働集約的なHEK293T細胞培養を使用せずに、細胞工場プラットフォームを使用して高収量で高純度のAAVベクターを生成するプロセスを効率化し、ポリエチレングリコール/水性二相分配とiodixanol勾配超遠心分離を統合した独自の方法を紹介します。AAVベクターの純度はSDS-PAGEと銀染色によって確認され、透過型電子顕微鏡(TEM)を使用してフル粒子とエンプティ粒子の比率が決定され、 in vivo 研究の品質基準を満たしています11。
ここでは、細胞工場プラットフォーム(CF10)を使用して高力価で高品質なAAVベクターを大規模に生産するための技術的に高度なプロトコールを紹介します。これは、従来の細胞培養ディッシュ法に比べて大幅に改善されています。細胞工場の使用は、大量の細胞を培養するプロセスを簡素化し、AAVウイルスの産生をより効率的に促進します1。また、培養条件を最適化することにより、特に低グルコースDMEMに10 mM HEPESと2% FBSを添加すると、ウイルス産生が有意に増加することが確認され、ウイルス収量における細胞環境の重要な役割が示されました。
改訂された精製プロトコルは、細胞ペレットと培養培地の両方からのAAVを組み合わせたもので、多くの既存のプロトコルに見られる低ウイルス収量と不純物という共通の問題に対処しています。クロロホルム抽出と水性二相分配のステップにより、ほとんどのタンパク質汚染物質が効果的に除去され、AAVは硫酸アンモニウム相に可溶性のままです。従来のグラジエント超遠心分離法とは対照的に、PEG/水性二相分配とヨージキサノール勾配超遠心分離を組み合わせたAAVベクターの収量と純度の両方の向上は、PEG/水性二相分配による初期分離の強化、ヨージキサノール勾配超遠心分離による精製純度、および汚染物質の共精製の減少に起因する可能性があります12.まず、超遠心分離の前にPEG/水性二相分配を導入することで、細胞の破片やその他の汚染物質からのAAV粒子の初期分離が大幅に改善されます。高分子量ポリマーであるPEGは、水溶液と混合すると、2つの異なる相13を生成する。AAV ベクターは、これらの相の 1 つ (通常は PEG リッチ相) に優先的に分配する傾向がありますが、多くの汚染物質や不純物は他の13 に分配されます。この選択的分配により、AAV粒子が効果的に濃縮され、超遠心分離前であってもかなりの部分の不純物が除去されるため、収率が向上し、超遠心分離ステップ13に入る汚染物質負荷が減少します。次に、ヨージキサノールグラジエント超遠心分離により、AAVベクターの純度がさらに向上します。ヨウオジキサノールは、非イオン性の等浸透圧グラジエント培地であり、従来のCsClグラジエントと比較して、より穏やかで制御された分離を可能にします14。この勾配では、AAV粒子は、その浮力密度14に対応する勾配内の位置に移動する。重要なことに、このプロセスは、ベクターの品質の重要な決定要因である空のカプシド(遺伝物質を含まない)から完全なAAVカプシド(遺伝的ペイロードを含む)を分離するのに効果的です。また、ヨウジキサノールの等浸透圧性は、CsClのような高浸透圧剤よりもAAVカプシドの完全性をよりよく保持し、無傷の機能的なベクターのより高い収率につながる可能性があります14。最後に、従来の超遠心分離法、特にCsClグラジエントを使用する方法では、AAVベクター15と同様の浮力密度を持つ汚染物質を共精製できる場合があります。予備ステップとしてPEG分配を使用することにより、超遠心分離13の前に、そのような汚染物質の負荷が大幅に減少する。この汚染物質負荷の減少は、イオジキサノールグラジエントがAAVベクターの精製においてより効果的かつ選択的に機能できることを意味し、より高い純度15につながります。
AAVベクターの純度と品質は、銀染色とTEM11によって厳密に評価されます。AAVキャプシドタンパク質VP1、VP2、VP3に対応する3つの主要なバンドが90%を超える純度で観察されたことは、これらのAAVベクターの in vivo 使用への適合性を示しています。空キャプシドの割合が高いと、遺伝子送達効率が低下し、免疫応答が可能になる可能性があるため、フルキャプシドとエンプティキャプシドの比率を決定するためのTEM分析は特に重要です11。この品質チェックは不可欠ですが、手続きの複雑さを増し、追加の技術的専門知識が必要になる場合があります。
結論として、このプロトコルは、AAVベクターの製造において、特にスケーラビリティと純度の点で、大幅な技術的進歩を提供します。しかし、精製プロセスに関連する複雑さや、特殊な機器や専門知識の必要性は、特定の研究環境での応用には依然として小さな制限となる場合があります。これらの技術をさらに洗練し、簡素化することで、このアプローチを遺伝子治療研究の分野においてよりアクセスしやすく、広く適用できるようになる可能性があります。
The authors have nothing to disclose.
TZが実験を設計しました。TZ、VD、SB、およびJPが実験を行いました。TZとVDがデータを生成し、データを分析しました。TZとYXが原稿を書きました。TZとGGが原稿を改訂しました。この活動は、ピッツバーグのUPMC小児病院の支援を受けました。
293T/17 cells | ATTC | CRL-11268 | |
(NH4)2SO4 | Millipore Sigma | 1.01217.1000 | |
0.5 M EDTA | MilliporeSigma | 324506-100ml | |
1 mL Henke-Ject syringe | Fisher Scientific | 14-817-211 | |
10% pluronic F68 solution | Fisher Scientific | 24-040-032 | |
10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Biorad | 1610732 | |
1M HEPES | Fisher Scientific | 15-630-080 | |
2% Uranyl Acetate Solution | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
4%–20% Precast Protein Gels | biorad | 4561094 | |
40% PEG solution | Sigma | P1458-50ML | |
AAV6 reference full capsids | Charles River Laboratories | RS-AAV6-FL | |
Accutase Cell Detachment Solution | Fisher Scientific | A6964-100ML | |
Benzonase | Sigma | E1014-25KU | |
BioLite Cell Culture Treated Dishes 150 mm | Fisher Scientific | 12-556-003 | |
Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC905024 | |
Corning PES Syringe Filters | Fisher Scientific | 09-754-29 | |
Dialysis Cassettes, 10 K MWCO | Fisher Scientific | PI66810 | |
Disposable PES Filter Units 1 L 0.2 µm | Fisher Scientific | FB12566506 | |
Disposable PES Filter Units 1 L 0.45 µm | Fisher Scientific | FB12566507 | |
Disposable PES Filter Units 500 mL 0.2 µm | Fisher Scientific | FB12566504 | |
DMEM high glucose | Fisher Scientific | 10-569-044 | |
DMEM low glucose | Fisher Scientific | 10567022 | |
DNase | NEB | M0303S | |
DPBS 1x | Fisher Scientific | 14-190-250 | |
Fetal Bovin Serum (FBS) | Biowest | S1620 | |
Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu | Electron Microscopy Sciences | FCF300-Cu-50 | |
glycerol | Sigma | G5516-1L | |
KCl | Sigma | P9541-500G | |
LB agar | Sigma | L2897-250G | |
LB broth | Fisher Scientific | BP9732-500 | |
MgCL2·6H2O | Sigma | M9272-100G | |
NEB stable competent cells | NEB | C3040H | |
Nest Biofactory 10 chamber | MidSci | 771302 | |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | 740424 | |
Opti-MEM | Fisher Scientific | 31-985-088 | |
OptiPrep Density Gradient Medium | Millipore Sigma | D1556-250ml | |
pAAV-CMV-GFP | Addgene | 105530 | |
pAAV-DJ | Cell BioLab | VPK-420-DJ | |
pAAV-RC6 | Cell BioLab | VPK-426 | |
pAdDeltaF6 | Addgene | 112867 | |
PEG 8000 | Promega | V3011 | |
PEI Max | Polysciences, Inc | 49553-93-7 | |
Pen-Strep | Fisher Scientific | 15-140-163 | |
Phenol red | Millipore Sigma | 1.07242.0100 | |
Pierce Silver Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | 24612 | |
QuickSeal tube | Fisher Scientific | NC9144589 | |
Sodium Chloride | Sigma | 1162245000 | |
sodium deoxycholate | Millipore Sigma | D6750-100G | |
Taqman Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444557 | |
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32209 |