Производство высокопродуктивных партий аденоассоциированных векторов с использованием суспензионных ячеек HEK293
Summary
В данной работе представлен протокол производства AAV на основе суспензии HEK293, что приводит к сокращению времени и трудозатрат, необходимых для производства векторов с использованием компонентов, доступных для исследовательских целей у коммерческих поставщиков.
Abstract
Аденоассоциированные вирусные векторы (ААВ) являются замечательным инструментом для исследования центральной нервной системы (ЦНС). Инновационные капсиды, такие как AAV. PHP.eB, демонстрируют обширную трансдукцию ЦНС путем внутривенной инъекции у мышей. Для достижения сопоставимой трансдукции необходим в 100 раз более высокий титр (минимум 1 x 1011 копий генома на мышь) по сравнению с прямой инъекцией в паренхиму ЦНС. В нашей группе производство AAV, в том числе AAV. PHP.eB опирается на адгезивные HEK293T клетки и метод тройной трансфекции. Достижение высоких выходов AAV с адгезивными клетками влечет за собой трудоемкий и материалоемкий процесс. Это ограничение послужило толчком к разработке протокола для суспензионных клеточных культур в конических пробирках. AAV, образующиеся в адгезивных клетках, сравнивали с методом получения суспензии. Сравнивали культуру в суспензии с использованием трансфекционных реагентов Полиэтиленимин или ТрансИт. Векторы AAV очищали с помощью ультрацентрифугирования с градиентом йодиксанола с последующим буферным обменом и концентрированием с использованием центробежного фильтра. С помощью адгезивного метода мы получили в среднем 2,6 x 1012 копий генома (GC), в то время как метод суспензии и полиэтиленимина дал в общей сложности 7,7 x 1012 GC, а TransIt — 2,4 x 1013 GC. Нет различий в эффективности трансдукции in vivo между векторами, полученными с адгезивной системой, по сравнению с системой суспензионных клеток. Таким образом, внедрен протокол производства AAV на основе суспензии HEK293, что приводит к сокращению времени и трудозатрат, необходимых для производства векторов, при достижении в 3-9 раз более высокой производительности при использовании компонентов, доступных у коммерческих поставщиков для исследовательских целей.
Introduction
Аденоассоциированный вирус (AAV) был открыт в 1965 году и с тех пор используется во множествеприложений1. AAV применяются в исследованиях в области неврологии для изучения функций генов и нейронов, картирования нейроцепей или создания животных моделей заболевания2. Традиционно это делается путем инъекции непосредственно в интересующее место, так как большинство естественных серотипов не пересекают гематоэнцефалический барьер и не нуждаются в высокой дозедля этого.
С открытием AAV. PHP.B4 и капсиды следующего поколения, такие как AAV. PHP.eB5 и AAV. CAP-B106, можно воздействовать на центральную нервную систему (ЦНС) с помощью простой системной инъекции. Пространственное сопоставление выявляет ячейки, на которые нацелен AAV. PHP.eB на клеточном уровне 6,7. В сочетании со специфическими промоторами/энхансерами эти капсиды предоставляют нейробиологам широкие возможности для изучения генов и функций мозга путем неинвазивной доставки AAV 4,8.
В то время как для AAV необходима меньшая доза. PHP.eB (обычно от 1 до 5 x 1011 копий генома (GC)/мышь) по сравнению с AAV9 (4 x10 12 GC/мышь)7, требуется еще больше векторов по сравнению со стратегиями прямого введения (обычно 1 x 109 GC/мкл инъекции). Большинство натуральных серотипов могут быть получены с использованием классической адгезивной системы культивирования клеток в сочетании с очисткой йодиксанолом 9,10,11,12. Для AAV. PHP.eB Это влечет за собой трудоемкий процесс культивирования и трансфекции клеток для получения достаточного количества векторов для одного эксперимента8. Поэтому было разработано производство AAV в культуре суспензионных клеток в конических пробирках. Конические пробирки, емкостью до 300 мл, компактны, экономят как место в инкубаторе, так и пластик. Суспензионные клетки гораздо легче культивировать и обрабатывать в больших количествах, чем адгезивные клетки на 15-сантиметровых планшетах. Трансфекционные компоненты протокола остаются прежними. Таким образом, плазмиды, ранее использовавшиеся с адгезивной системой, могут быть легко использованы в этом протоколе, основанном на производстве в суспензионных клетках. Протокол был успешно передан другим исследователям в лаборатории и успешно использован для различных капсидов и конструкций.
Protocol
Representative Results
Discussion
Системное введение ААВ является мощным инструментом для переноса генов в ЦНС; однако производство AAV является дорогостоящим и трудоемким процессом. При использовании суспензионных ячеек трудозатраты и пластмассы снижаются по сравнению с адгезивной культурой HEK293T на пластинах 15 см2…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом исследовательского фонда Королевской академии искусств и наук Нидерландов (KNAW) и грантом Start2Cure (0-TI-01). Мы благодарим Лейшу Копп за ее вклад и советы по настройке протокола. Фигуры были созданы с помощью Biorender.
Materials
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep – Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
References
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
- Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).
- Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
- Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960 (2019).
- Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
- Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
- Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
- Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
- Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).
