Production de lots de vecteurs associés à l’adénographie à haut rendement à l’aide de cellules en suspension HEK293
Summary
Ici, un protocole de production d’AAV à base de cellules HEK293 en suspension est présenté, ce qui permet de réduire le temps et la main-d’œuvre nécessaires à la production de vecteurs à l’aide de composants disponibles à des fins de recherche auprès de fournisseurs commerciaux.
Abstract
Les vecteurs viraux adéno-associés (AAV) sont un outil remarquable pour étudier le système nerveux central (SNC). Capsides innovantes, telles que l’AAV. PHP.eB, démontrent une transduction étendue du SNC par injection intraveineuse chez la souris. Pour obtenir une transduction comparable, un titre 100 fois plus élevé (au moins 1 x 1011 copies du génome/souris) est nécessaire par rapport à l’injection directe dans le parenchyme du SNC. Dans notre groupe, la production d’AAV, y compris l’AAV. PHP.eB s’appuie sur des cellules HEK293T adhérentes et la méthode de triple transfection. L’obtention de rendements élevés d’AAV avec des cellules adhérentes implique un processus à forte intensité de main-d’œuvre et de matériel. Cette contrainte a incité le développement d’un protocole de culture cellulaire en suspension dans des tubes coniques. Les AAV générés dans les cellules adhérentes ont été comparés à la méthode de production en suspension. Culture en suspension à l’aide de réactifs de transfection Polyéthylénimine ou TransIt ont été comparées. Les vecteurs AAV ont été purifiés par ultracentrifugation par gradient d’iodixanol suivie d’un échange de tampon et d’une concentration à l’aide d’un filtre centrifuge. Avec la méthode adhérente, nous avons obtenu une moyenne de 2,6 x 1012 copies du génome (GC) au total, tandis que la méthode en suspension et la polyéthylénimine ont donné 7,7 x 1012 GC au total, et TransIt a donné 2,4 x 1013 GC au total. Il n’y a pas de différence dans l’efficacité de la transduction in vivo entre les vecteurs produits avec des adhérents et ceux du système de cellules en suspension. En résumé, un protocole de production d’AAV à base de cellules HEK293 en suspension est introduit, ce qui permet de réduire le temps et la main-d’œuvre nécessaires à la production de vecteurs tout en obtenant des rendements 3 à 9 fois plus élevés en utilisant des composants disponibles auprès de fournisseurs commerciaux à des fins de recherche.
Introduction
Le virus adéno-associé (AAV) a été découvert en 1965 et a depuis été utilisé dans une myriade d’applications1. Les AAV ont été utilisés dans la recherche en neurosciences pour étudier les gènes et la fonction neuronale, cartographier les neurocircuits ou produire des modèles animaux pour la maladie2. Traditionnellement, cela se fait en injectant directement sur le site d’intérêt, car la plupart des sérotypes naturels ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique ou n’ont pas besoin d’une dose élevée pour le faire 1,2,3.
Avec la découverte de l’AAV. PHP.B4 et les capsides de nouvelle génération telles que l’AAV. PHP.eB5 et AAV. CAP-B106, il est possible de cibler le système nerveux central (SNC) par une simple injection systémique. La cartographie spatiale révèle les cellules ciblées par AAV. PHP.eB au niveau cellulaire 6,7. En combinaison avec des promoteurs/amplificateurs spécifiques, ces capsides offrent de nombreuses possibilités aux neuroscientifiques d’étudier les gènes et la fonction cérébrale par administration non invasive d’AAV 4,8.
Alors qu’une dose plus faible est nécessaire pour l’AAV. PHP.eB (généralement 1 à 5 x 1011 copies du génome (GC)/souris) par rapport à AAV9 (4 x 1012 GC/souris)7, il faut produire encore plus de vecteurs par rapport aux stratégies d’injection directe (généralement 1 x 109 GC/μL injection). La plupart des sérotypes naturels peuvent être produits en utilisant le système classique de culture cellulaire adhérente en combinaison avec la purification à l’iodixanol 9,10,11,12. Pour AAV. PHP.eB : cela implique un processus laborieux de culture et de transfection des cellules afin d’obtenir suffisamment de vecteurs pour une expérience8. Par conséquent, la production d’AAV en culture cellulaire en suspension dans des tubes coniques a été développée. Les tubes coniques, d’une capacité allant jusqu’à 300 ml, sont compacts, ce qui permet d’économiser à la fois de l’espace dans l’incubateur et des plastiques. Les cellules en suspension sont beaucoup plus faciles à cultiver et à manipuler en grande quantité que les cellules adhérentes sur des plaques de 15 cm. Les composants de transfection du protocole restent les mêmes. Par conséquent, les plasmides précédemment utilisés avec le système adhérent peuvent facilement être utilisés dans ce protocole basé sur la production dans des cellules en suspension. Le protocole a été transféré avec succès à d’autres chercheurs du laboratoire et utilisé avec succès pour diverses capsides et constructions.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’administration systémique d’AAV est un outil puissant pour le transfert de gènes vers le SNC ; cependant, la production d’AAV est un processus coûteux et laborieux. En utilisant des cellules en suspension, la main-d’œuvre et les plastiques sont réduits par rapport à la culture adhérente de HEK293T sur des plaques de 15 cm2 . De plus, les tubes coniques mis en œuvre ici sont faciles à manipuler et maximisent l’utilisation de l’espace de laboratoire. Le protocole a été mis en place par d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention du fonds de recherche de l’Académie royale des arts et des sciences des Pays-Bas (KNAW) et une subvention de Start2Cure (0-TI-01). Nous remercions Leisha Kopp pour sa contribution et ses conseils dans la mise en place du protocole. Les figurines ont été créées à l’aide de Biorender.
Materials
| 39 mL, Quick-Seal Round-Top Polypropylene Tube, 25 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter | 342414 | |
| Adapter 600 mL conical tubes, for rotor S-4×1000, | eppendorf | 5920701002 | |
| Adapter Plate fits 16 bioreactors of 600 ml | Infors HT/ TPP | 587633 | |
| Aerosol-tight caps, for 750 mL round buckets | eppendorf | 5820747005 | |
| Centrifuge 5920 R G, 230 V, 50-60 Hz, incl. rotor S-4×1000, round buckets and adapter 15 mL/50 mL conical tubes | eppendorf | 5948000315 | |
| Distilled Water | Gibco | 15230147 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DNase I recombinant, RNase-free | Roche | 4716728001 | |
| DPBS, calcium, magnesium | Gibco | 14040091 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,2 | Fisher | FB12566504 | |
| Fisherbrand Disposable PES Filter Units 0,45 | Fisher | FB12566505 | |
| Holder for 50 ml culture tubes also fits falcon tube | Infors HT/ TPP | 31362 | |
| Holder for 600 ml cell culture tube | Infors HT/ TPP | 66129 | |
| Incubator Minitron 50 mm | Infors HT | 500043 | |
| LV-MAX Production Medium | Gibco | A3583401 | |
| N-Tray Universal | Infors HT/ TPP | 31321 | |
| OptiPrep – Iodixanol | Serumwerk bernburg | 1893 | |
| PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000) | Poly-sciences | 24765-100 | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | 72420100 | |
| Poly(ethylene glycol) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| TransIT-VirusGEN | Mirus | Mir 6706 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 5250061 | |
| TubeSpin Bioreactors-50ml | TTP | 87050 | |
| TubeSpin Bioreactors-600ml | TTP | 87600 | |
| Viral Production Cells | Gibco | A35347 | |
| Vivaspin 20 MWCO 100 000 | Cytvia | 28932363 |
References
- Zhou, K., Han, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhu, C. Routes of administration for adeno-associated viruses carrying gene therapies for brain diseases. Front Mol Neurosci. 15, 988914 (2022).
- Pietersz, K. L., et al. PhP.B Enhanced adeno-associated virus mediated-expression following systemic delivery or direct brain administration. Front Bioeng Biotechnol. 9, 679483 (2021).
- Zhang, H., et al. Several rAAV vectors efficiently cross the blood–brain barrier and transduce neurons and astrocytes in the neonatal mouse central nervous system. MolTher. 19 (8), 1440-1448 (2011).
- Deverman, B. E., et al. Cre-dependent selection yields AAV variants for widespread gene transfer to the adult brain. Nat Biotechnol. 34 (2), 204-209 (2016).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nat Neurosci. 20, 1172-1179 (2017).
- Goertsen, D., et al. AAV capsid variants with brain-wide transgene expression and decreased liver targeting after intravenous delivery in mouse and marmoset. Nat. Neurosci. 25 (1), 106-115 (2022).
- Foust, K. D., et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2008).
- Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).
- Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Production Holt, M. G. purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. J Vis Exp. (143), e58960 (2019).
- Fagoe, N. D., Eggers, R., Verhaagen, J., Mason, M. R. J. A compact dual promoter adeno-associated viral vector for efficient delivery of two genes to dorsal root ganglion neurons. Gene Thr. 21 (3), 242-252 (2014).
- Verhaagen, J., et al. Retinal gene therapy, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1715, 3-17 (2018).
- Nasse, J. S., et al. Addgene AAV data hub: A platform for sharing AAV experimental data. Nat Meth. 20 (9), 1271-1272 (2023).
- Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
- Blessing, D., Déglon, N., Schneider, B. L. Recombinant protein expression in mammalian cells, methods and protocols. Meth Mol Biol. 1850, 259-274 (2018).
