Differentiatie en karakterisering van osteoclasten van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Osteoclasten (OC’s) zijn hematopoëtische ^1,2, veelzijdige celtypen die vaak worden gebruikt door onderzoekers op gebieden zoals onderzoek naar botziekten ^3,4, kankeronderzoek ^5,6, weefselmanipulatie ^7,8 en endoprotheseonderzoek ^9,10. Niettemin kan differentiatie van OC een uitdaging zijn, aangezien fusie van mononucleaire precursoren tot meerkernige OC’s noodzakelijk is om functionele OC’s te creëren¹¹. Verschillende biologische factoren, zoals receptoractivator van NF-KB-ligand (RANKL) en macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF), zijn nodig voor OC-differentiatie. Van M-CSF is gemeld dat het een positief effect heeft op celproliferatie, celoverleving en RANK-expressie 12,13,14. Aan de andere kant bindt RANKL zich aan RANK, dat stroomafwaartse signaalcascades activeert die osteoclastogenese induceren. Activering wordt gemedieerd via TNF-receptor-geassocieerde factor 6 (TRAF6), wat leidt tot de afbraak van de nucleaire factor van kappa light polypeptide genversterker in B-celremmer, alfa (IκB-α), een bindend eiwit dat NF-kB-dimeren^{bindt 16,17}. Vandaar dat bij de afbraak van IκB-α NF-kB-dimeren vrijkomen, die vervolgens in de kern worden verplaatst en de expressie van de transcriptiefactoren c-Fos en Nuclear Factor of Activated T-Cells 1 (NFATc1) induceren. Dit activeert op zijn beurt de transcriptie van een groot aantal OC-differentiatie-gerelateerde eiwitten^15,18. Opgereguleerde eiwitten zoals DC-Stamp en Atp6v0d2 mediëren cel-celfusie van OC-precursoren, wat leidt tot syncytiumvorming 19,20,21.

Met betrekking tot menselijke primaire cellen zijn CD34⁺ en CD14⁺ PBMC’s momenteel de meest gebruikte celtypen voor differentiatie in OC’s²². Deze aanpak wordt echter beperkt door de heterogeniteit binnen de CD34^+- populatie van geoogste cellen van donoren²³ en hun beperkte uitbreidbaarheid. Menselijke iPSC’s vormen een alternatieve bron voor OC’s. Omdat ze onbeperkt kunnen worden vermeerderd²⁴, maken ze uitbreidbaarheid en opschaling van de OC-productie mogelijk. Dit maakt het mogelijk om grote aantallen OC’s te differentiëren, wat OC-onderzoek vergemakkelijkt.

Er zijn verschillende protocollen gepubliceerd voor de differentiatie van iPSC’s in OC’s 25,26,27. Het hele differentiatieproces kan worden onderverdeeld in een iPSC-propagatiegedeelte, een mesodermale en hematopoëtische differentiatie-deel en OC-differentiatie. Propagatie van iPSC’s vóór het differentiatieproces maakt het mogelijk om de OC-productie op te schalen voorafgaand aan de differentiatie. Er bestaan verschillende benaderingen met betrekking tot mesodermale en hematopoëtische differentiatie. Traditioneel wordt de vorming van embryoïde lichamen (EB) gebruikt om hematopoëtische cellen te differentiëren, maar op monolagen gebaseerde benaderingen vertegenwoordigen een andere hematopoëtische differentiatiestrategie waarvoor geen EB-inductie nodig is. Desalniettemin lijken op monolagen gebaseerde systemen verdere optimalisatie te vereisen, aangezien wij en anderen hebben vastgesteld dat EB-gebaseerde benaderingen robuuster zijn voor de differentiatie van OC’s.

Hier beschrijven we de differentiatie van OC’s van menselijke iPSC’s met behulp van een EB-gebaseerd protocol. Dit protocol is aangepast van Rössler et ^al.26 en aangepast om de robuustheid te vergroten en cryopreservatie tijdens het differentiatieproces mogelijk te maken. Eerst oogstten we hematopoëtische cellen slechts één keer na 10 dagen differentiatie. Hematopoëtische cellen werden vervolgens gecryopreserveerd om meer flexibiliteit tijdens het differentiatieproces mogelijk te maken. Daarnaast verhoogden we de kiemdichtheid van de hematopoëtische cellen van 1 x 10⁵ naar 2 x 10⁵ cellen/^cm2 voor OC-differentiatie. Er werd gebruik gemaakt van een recenter humaan iPSC-serumvrij medium (hiPSC-SFM, zie Materiaaltabel) en de putjes werden gecoat met 200-300 μg/ml van een basaalmembraanextract (zie Materiaaltabel) in plaats van 0,1% gelatine. Penicilline/streptomycine werd niet aan de media toegevoegd.

Het protocol van Rössler et ^al.26 was oorspronkelijk aangepast van een iPSC naar een macrofaagdifferentiatieprotocol²⁸ dat EB-vorming gebruikt voor hematopoëtische differentiatie. Hoewel EB-vorming al langere tijd door onderzoekers wordt gebruikt voor hematopoëtische differentiatie^29,30, zijn er in de literatuur verschillende methoden van EB-inductie beschreven, zoals spontane aggregatie, centrifugatie in een putplaat met ronde bodem, hangende druppelcultuur, bioreactorcultuur, conische buiscultuur, langzaam draaiend lateraal vat en micromold-gelcultuur³¹. Dit protocol maakt gebruik van centrifugatie van gedissocieerde iPSC’s in een putplaat met ronde bodem om afzonderlijke iPSC-cellen dicht bij elkaar te brengen en bolvorming (EB) mogelijk te maken, zoals hieronder beschreven.