ヒト人工多能性幹細胞からの破骨細胞の分化と特性評価

破骨細胞(OC)は造血由来の^1,2汎用性の高い細胞タイプであり、骨疾患研究3,4、がん研究^5,6、組織工学^7,8、エンドプロテーゼ研究^9,10などの分野の研究者によって一般的に使用されています.それにもかかわらず、機能的なOCを作製するには単核前駆体の多核OCへの融合が必要であるため、OCの分化は困難な場合があります¹¹。OCの分化には、NF-κBリガンド受容体活性化因子(RANKL)やマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)など、いくつかの生物学的因子が必要です。M-CSFは、細胞増殖、細胞生存、およびRANK発現にプラスの効果をもたらすことが報告されています12,13,14。一方、RANKLはRANKに結合し、破骨細胞形成を誘導する下流のシグナル伝達カスケードを活性化します。活性化はTNF受容体関連因子6(TRAF6)を介して媒介され、NF-κB二量体に結合する結合タンパク質であるB細胞阻害剤α(IκB-α)のκ光ポリペプチド遺伝子エンハンサーの核因子の分解につながる^16,17。したがって、IκB-α分解によりNF-κB二量体が放出され、これが核内に移動し、転写因子c-Fosおよび活性化T細胞核因子1(NFATc1)の発現が誘導されます。これにより、多数のOC分化関連タンパク質の転写が引き起こされる^15,18。DC-StampやAtp6v0d2などのアップレギュレーションされたタンパク質は、OC前駆体の細胞間融合を媒介し、合胞体の形成を引き起こします^19,20,21。

ヒト初代細胞に関しては、CD34⁺ およびCD14⁺ PBMCが現在、OCへの分化に最も広く使用されている細胞型である²²。しかしながら、このアプローチは、ドナーから採取された細胞のCD34⁺ 集団内の不均一性²³ およびそれらの限られた拡張性によって制限される。ヒトiPS細胞は、OCの代替供給源となります。それらは無期限に伝播することができる^ので24、それらはOC生産の拡張性とアップスケーリングを可能にします。これにより、多数のOCの区別が可能になり、OC研究が容易になります。

iPS細胞をOCに分化させるためのいくつかのプロトコルが発表されています25,26,27。分化過程全体は、iPS細胞増殖部、中胚葉分化部、造血分化部、OC分化に分けられます。分化プロセスの前にiPS細胞を増殖させることで、分化前のOC産生のスケールアップが可能になります。中胚葉分化と造血分化に関しては、いくつかのアプローチがあります。従来、胚様体(EB)形成は造血細胞の分化に使用されてきましたが、単層ベースのアプローチは、EB誘導を必要としない別の造血分化戦略を表しています。それにもかかわらず、単層ベースのシステムは、EBベースのアプローチがOCの分化のためにより頑健であることを発見したため、さらなる最適化が必要であるようです。

ここでは、EBベースのプロトコルを用いたヒトiPS細胞からのOCの鑑別について説明します。このプロトコルは、Rössler et ^al.26 から採用され、頑健性を高め、分化プロセス中の凍結保存を可能にするように修正されました。まず、10日間の分化後に造血細胞を1回だけ採取しました。その後、造血細胞を凍結保存し、分化プロセス中の柔軟性を高めました。さらに、造血細胞の播種密度を1 x 10⁵ から2 x 10⁵ cells/cm² に増やし、OC分化に成功させました。より最近のヒトiPS細胞無血清培地(iPS細胞-SFM、 材料表参照)を使用し、0.1%ゼラチンの代わりに200-300μg/mLの基底膜抽出物( 材料表参照)でウェルをコーティングしました。ペニシリン/ストレプトマイシンは培地に添加しなかった。

Rösslerらによるプロトコル²⁶は、もともとiPS細胞から造血にEB形成を使用するマクロファージ分化プロトコル²⁸に適応したものである。EB形成は造血分化のために研究者によって長期間使用されてきましたが^29,30、EB誘導のいくつかの方法は、自発的凝集、丸底ウェルプレートでの遠心分離、吊り下げドロップ培養、バイオリアクター培養、円錐管培養、ゆっくりと回転する側方血管、およびマイクロモールドゲル培養³¹など、文献に記載されています.このプロトコルでは、解離したiPS細胞を丸底ウェルプレートで遠心分離し、単一のiPS細胞を互いに近づけ、以下で説明するように球体(EB)の形成を可能にします。