Este protocolo descreve como gerar fatias de pâncreas humano de doadores de órgãos falecidos para estudar a função celular em condições quase fisiológicas. Essa abordagem inovadora permite a investigação de ilhotas normais e estruturalmente danificadas e a intrincada interação entre os compartimentos endócrino e exócrino.
É crucial estudar o pâncreas humano para entender os mecanismos fisiopatológicos associados ao diabetes tipo 1 (DM1) e 2 (DM2), bem como a fisiologia e interação endócrina e exócrina do pâncreas. Muito foi aprendido com o estudo de ilhotas pancreáticas isoladas, mas isso impede o exame de sua função e interações no contexto de todo o tecido. As fatias do pâncreas oferecem uma oportunidade única de explorar a fisiologia de ilhotas normais, inflamadas e estruturalmente danificadas em seu ambiente nativo, permitindo o estudo das interações entre os compartimentos endócrinos e exócrinos para investigar melhor a dinâmica complexa do tecido pancreático. Assim, a adoção da plataforma de fatia de pâncreas vivo representa um avanço significativo no campo. Este protocolo descreve como gerar fatias de tecido vivo de doadores de órgãos falecidos por incorporação de tecido em fatiamento de agarose e vibrato, bem como sua utilização para avaliar leituras funcionais, como secreção dinâmica e imagens de células vivas.
Estudos sobre a fisiologia das ilhotas são fundamentais para a compreensão da patogênese do diabetes e desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Até agora, a pesquisa se baseou em ilhotas isoladas, o que expõe as ilhotas a tensões mecânicas e enzimáticas, provavelmente causando mudanças na fisiologia celular; Além disso, não é possível avaliar a função das ilhotas no contexto de seu ambiente tecidual natural, que provavelmente é impactado por células exócrinas e vasculares, entre outras1. Ao estudar o pâncreas de doadores com DM1, há o desafio de que suas ilhotas são difíceis de isolar e podem se fragmentar durante o isolamento, o que pode produzir um efeito de seleção em ilhotas que podem não representar a população in vivo2. Além disso, as ilhotas serão separadas de seu ambiente complexo e conexões celulares, especialmente das células imunes infiltrantes que são encontradas em ilhotas inflamadas e são mais abundantes na periferia das ilhotas. Assim, embora ilhotas isoladas sejam uma ferramenta fundamental na pesquisa do diabetes, existem limitações. Em resposta, introduzimos um protocolo inovador para gerar fatias vivas de pâncreas, oferecendo uma solução para esses desafios.
O recente desenvolvimento e adoção de técnicas de fatiamento de tecido pancreático é considerado um avanço para nossa capacidade de explorar a intrincada biologia e funções do pâncreas. Essa inovação abriu novos caminhos para estudos dinâmicos da fisiologia das ilhotas e interações entre células endócrinas, exócrinas, neurais, vasculares e imunes dentro de seu contexto anatômico natural. Ao contrário das abordagens convencionais, esse cenário in vitro preserva grande parte da citoarquitetura do órgão, permitindo uma aproximação mais próxima de sua biologia nativa. Inicialmente desenvolvido em camundongos por Speier e Rupnik em 20033, este método demonstrou sua utilidade para avaliar imagens de cálcio, eletrofisiologia e secreção hormonal para sinalização intra e intercelular 4,5,6,7,8,9. A plataforma de corte de pâncreas foi então aplicada ao estudo do tecido pancreático humano obtido por biópsia cirúrgica 4,10,11,12. Nosso grupo demonstrou a viabilidade de obtenção e utilização de fatias de pâncreas de doadores de órgãos de cadáveres por meio da atividade da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD)13. O nPOD fornece tecidos do pâncreas para investigadores aprovados que conduzem pesquisas sobre diabetes tipo 1 humano e, desde a adoção da plataforma de fatias do pâncreas, o nPOD rotineiramente gera e distribui fatias vivas do pâncreas 14,15,16,17. Desde a implementação da plataforma de fatias de pâncreas em 2020, o nPOD distribuiu com sucesso fatias de tecido de 43 doadores (incluindo 12 doadores com DM1) para vários investigadores. Usando essas fatias, os pesquisadores realizaram pesquisas inovadoras sobre aspectos críticos da função das ilhotas e exploraram a interação entre as ilhotas e a vasculatura, o sistema nervoso e as células imunológicas no contexto do DM113 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. Numerosos estudos destacaram as limitações das abordagens tradicionais e ressaltaram a importância de técnicas que podem capturar a interação dinâmica dentro do pâncreas 25,26,27. A adaptabilidade das técnicas de fatiamento do pâncreas de camundongo ao pâncreas humano, juntamente com sua integração em programas como a Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD), exemplifica o crescente reconhecimento do potencial do método para desbloquear informações valiosas sobre doenças como diabetes tipo 1.
Aqui apresentamos um protocolo para gerar fatias de tecido pancreático viáveis e seu uso para leituras funcionais como secreção hormonal dinâmica e imagem funcional. Semelhante ao isolamento das ilhotas humanas, o sucesso do procedimento de corte é influenciado por vários fatores, incluindo características do doador, tempo de envio do tecido e qualidade do tecido25,29. Portanto, é crucial selecionar cuidadosamente amostras de tecido para o experimento e manter os tempos de isquemia no mínimo. Nesse contexto, outras fontes potenciais de tecido humano além dos doadores cadáveres devem ser cuidadosamente consideradas. A inclusão de doadores cirúrgicos oferece a opção de combinar dados de cortes funcionais com informações in vivo relevantes do mesmo paciente, fortalecendo a relevância translacional11. No entanto, essa fonte de tecido traz outros fatores, pois as biópsias geralmente são de pacientes mais velhos submetidos à pancreatectomia, principalmente devido a um tumor localizado. Notavelmente, as biópsias do pâncreas não são realizadas no contexto do diabetes.
Ao realizar o procedimento de fatiamento real, o processamento oportuno do tecido é fundamental. As fatias podem ser armazenadas por várias horas, conforme descrito neste protocolo, ou cultivadas por longos períodos, conforme descrito por Qadir et al.19. Atualmente, este protocolo é o único método para sustentar a viabilidade do slice por períodos prolongados, no entanto, esforços futuros devem avaliar as mudanças funcionais em diversos tempos de cultivo e fazer comparações com ilhotas isoladas, do mesmo doador.
A etapa mais crítica do processo é a preparação cuidadosa do tecido antes de incorporá-lo à agarose. Grandes ductos e tecido fibrótico podem complicar o processo de corte e potencialmente levar à quebra de blocos de tecido da agarose. Se isso ocorrer e as peças permanecerem de tamanho razoável, elas podem ser reprocessadas e incorporadas para fatiamento. Manter a boa qualidade do tecido e o processamento cuidadoso aumentam muito a eficiência do procedimento de fatiamento e produzem a quantidade e a qualidade máximas de fatias. O tempo decorrido desde a preparação do tecido até a geração do corte não deve exceder 2-3 h, pois intervalos mais longos afetam significativamente a viabilidade do tecido.
Durante a perifusão do corte, uma etapa simples, mas crítica, é o corte preciso do corte para garantir um ajuste perfeito na câmara. Isso permite o banho adequado do tecido e o fluxo ininterrupto. Uma vez iniciado o protocolo, é essencial evitar mais manipulações das câmaras para evitar picos indesejados na liberação de hormônios. Um tampão suficiente deve ser preparado e a tubulação deve atingir o fundo da solução para evitar a sucção do ar e as câmaras secarem.
Para imagens de cálcio, é importante escolher cuidadosamente a área de interesse, dependendo das necessidades experimentais e do projeto. É importante minimizar o fotobranqueamento escolhendo parâmetros de imagem que reduzam a exposição à luz ou encurtem o tempo geral do protocolo. Assim como a secreção hormonal dinâmica, é crucial manter o fluxo adequado da solução e uma configuração aquecida, pois as fatias requerem condições quase fisiológicas para uma função ideal (por exemplo, 37 °C).
As fatias de tecido pancreático mantêm efetivamente a integridade estrutural do pâncreas, preservando as conexões célula-célula entre seus diversos tipos de células. Consequentemente, eles fornecem uma alternativa ao trabalho com ilhotas isoladas, facilitando a exploração simultânea de funções endócrinas e exócrinas e sua interação. Para avaliar a interação de tipos de células individuais, é crucial discriminá-los. A coloração posterior é uma opção, mas tem limitações em termos de sondas fluorescentes disponíveis e o desafio de localizar camadas celulares exatas. Portanto, é aconselhável incorporar estímulos específicos da célula no protocolo para permitir a discriminação celular com base nas respostas. Para discriminar entre tipos de células em fatias de camundongos ou humanos, estímulos eficazes incluem adrenalina para células alfa21,30, grelina para células delta31, ceruleína para células acinares 5,32, ácidos biliares para células ductais33 e norepinefrina para células vasculares22. Estímulos semelhantes podem ser empregados para medir as respostas secretoras. Enquanto os estudos de imagem se concentram em células individuais, os estudos de secreção analisam a resposta coletiva. Portanto, é crucial incluir um amplo número de fatias para detectar os resultados desejados. A quantidade ideal pode variar entre os tipos de células, com três fatias provando ser suficientes para as células endócrinas; no entanto, é aconselhável usar mais fatias para garantir a detectabilidade, em vez de correr o risco de perder informações valiosas.
Como qualquer outro método, os cortes de tecido têm limitações que devem ser consideradas na interpretação dos resultados. A aplicação de estímulo direcionada a tipos de células específicas pode levar a efeitos em outros tipos de células na fatia, potencialmente desencadeando ciclos de feedback. No entanto, esses também são importantes para estudar e, portanto, as respostas medidas podem ser mais representativas de uma resposta fisiológica. Para o direcionamento seletivo de células, protocolos tradicionais in vitro podem ser usados. É importante ressaltar que as células acinares contêm enzimas pancreáticas que podem quebrar proteínas e digerir a fatia do tecido, resultando em degradação celular em questão de horas. Para manter a viabilidade, o uso consistente de inibidores de tripsina é essencial quando as fatias estão em estado estático, mesmo que sua aplicação possa interferir na transferência bem-sucedida de vírus empregados para fins de rotulagem.
Em comparação com o isolamento das ilhotas, a variabilidade do doador e a qualidade do tecido podem afetar tanto a quantidade quanto a viabilidade das fatias obtidas. A viabilidade insuficiente pós-fatiamento pode resultar em uma vida útil curta e prejudicar a capacidade de cultivar as fatias. Além disso, a contagem de ilhotas pode variar significativamente entre os doadores, tornando difícil estimar o conteúdo das ilhotas antes de realizar experimentos. Consequentemente, a seleção cuidadosa dos critérios de aceitação do doador e a implementação de métodos de normalização apropriados, como a porcentagem de conteúdo hormonal para secreção ou mudança de dobra para a linha de base, são cruciais. Para resultados consistentes, é aconselhável avaliar a viabilidade do corte de tecido antes do experimento. Além disso, recomenda-se a incorporação de estímulos de controle relevantes (por exemplo, KCl) no experimento. Em casos de análise celular individual, como imagens, pode ser implementada a pré-classificação de células com base em sua resposta a esses estímulos de controle. Apesar dos desafios mencionados, as fatias oferecem um aumento valioso aos métodos de pesquisa atuais.
O protocolo descrito pode ser usado como ponto de partida para várias aplicações, e as fatias do pâncreas podem ser manipuladas e as respostas examinadas após uma variedade de estímulos. Também direcionamos os leitores para vários estudos de pesquisa utilizando fatias de pâncreas de camundongos ou humanos, fornecendo informações valiosas para aqueles que planejam seus experimentos. No futuro, é possível que terapias potenciais possam ser investigadas usando fatias pancreáticas ou que os mecanismos da doença possam ser modelados.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi realizada com o apoio da Rede de Doadores de Órgãos Pancreáticos com Diabetes (nPOD; RRID:SCR_014641), um projeto colaborativo de pesquisa de diabetes tipo 1 apoiado pela JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) e The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant#2018PG-T1D053, G-2108-04793). O conteúdo e as opiniões expressas são de responsabilidade dos autores e não refletem necessariamente a visão oficial do nPOD. As Organizações de Aquisição de Órgãos (OPO) em parceria com o nPOD para fornecer recursos de pesquisa estão listadas em http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Os autores são gratos aos doadores e suas famílias por sua inestimável contribuição. Este trabalho foi apoiado pela American Diabetes Association 4-22-PDFPM (J.K.P.) e pelo Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust (concessão 2015-PG-T1D-052).
Alanine | Sigma | A7627 | amino acid |
AlexaFluor 488 goat anti-guineapig | Invitrogen | A11073 | secondary antibody |
AlexaFluor 546 goat anti-rat | Thermo Fisher | A11077 | secondary antibody |
AlexaFluor 647 goat anti-mouse | Thermo Fisher | A21235 | secondary antibody |
Aprotinin | Sigma | A1153 | inhibitor |
Arginine | Sigma | A5006 | amino acid |
Calbryte 520 AM | AAT Bioquest | 20651 | Calcium dye |
Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | Calcium dye |
Fluorescein diacetat | Sigma | F7378 | viability marker |
Glucagon | Sigma | G2654 | primary antibody |
Glucagon ELISA (human kit) | Mercodia | 10-1271-01 | ELISA for hormone detection |
Glutamine | Sigma | G3126 | amino acid |
Insulin | Dako | A-0546 | primary antibody |
Insulin ELISA (human) | Mercodia | 10-1113-01 | ELISA for hormone detection |
Low melting point agarose | Sigma | A9414 | |
LSM 900 | Zeiss | confocal microscope | |
Pancreas Slice Chamber | Biorep Technologies | PERI-PSC-001 | slice chamber for perifucion |
Pancreas Slice Chamber Extender Kit | Biorep Technologies | PERI-PSC-EXT | slice chamber for perifucion |
Pancreas Slice Chamber Perforated Plate | Biorep Technologies | PERI-PSC-PP | slice chamber for perifucion |
Perifusion system with automated tray handling | Biorep Technologies | PERI4-02-230-FA | |
Propidium iodide | Life technologies | P1304MP | dead marker |
Semi-automatic vibratome VT1200S | Leica | 14048142066 | |
Somatostatin | Millipore | MAB354 | primary antibody |